摘要
高通量測序技術（nextgeneration sequencing， NGS）平臺提供了一種高效、快速、低成本、深度測序DNA的解決方案，2009年該技術開始被應用于植物病毒學領域，包括新病毒的發現，病害病原的鑒定，病毒基因組多樣性及進化的研究，顯著加快了植物病毒學的發展進程。迄今，應用高通量測序技術已經成功鑒定了上百種新的植物病毒和類病毒。雙生病毒是一類對多種作物造成毀滅性危害的DNA病毒，多發生于草本作物。然而利用高通量測序技術，從柑橘、葡萄、蘋果和桑樹等多種多年生木本植物中檢測到了新的雙生病毒，顯示出了高通量測序技術所獨有的、傳統檢測技術所不具備的優勢。本文圍繞高通量測度技術在植物病毒學領域的應用進行概述，重點闡述NGS用于檢測木本植物雙生病毒的幾個實例。
關鍵詞
高通量測序；雙生病毒；植物病毒診斷；木本植物
中圖分類號：S 432.41
文獻標識碼：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.001
Abstract
Nextgeneration sequencing （NGS） platforms provide highly efficient， rapid， lowcost highthroughput DNA sequencing. Since 2009， NGS has been applied to plant virology， including discovery of novel viruses， identification of pathogens and analysis of genome diversity and evolution， which speeds up the process of plant virology research. Over one hundred novel plant viruses and/or viroids have been successfully identified by NGS so far. Geminiviruses （Family Geminiviridae） with circular， singlestranded DNA genome have caused devastating effect on many crops. To our knowledge， most of them generally infect herbaceous plants. However， many new geminiviruses， recently identified by NGS， were detected from perennial woody plants like citrus， grapevine， apple and mulberry. These studies have shown the superiority of NGS technology over conventional detection protocols. This paper reviews the application of NGS in plant virology and mainly demonstrates its application in detection of geminiviruses from perennial woody fruit trees.
Key words
nextgeneration sequencing；geminiviruses；diagnosis of plant virus；perennial woody plant
1高通量測序技術
1.1高通量測序平臺的建立及應用
2005年，傳統的桑格測序技術 （Sanger sequencing）遭遇了革命性的沖擊，更準確、更快速的高通量測序技術誕生了[1]。美國羅氏公司的Roche 454測序平臺的推出，開創了高通量測序的先河，此后，美國Illumina公司和ABI公司相繼推出Solexa[2]和SOLiD [34] 測序技術。高通量測序技術的誕生是基因組學領域一個具有里程碑意義的事件[57]，為現代生命科學的研究提供了前所未有的機遇[8]。
與傳統的桑格測序相比，高通量測序技術在測序速度和通量上有了巨大提高，測序成本也大大降低。以人類基因組計劃為例，2001年，人類基因組草圖發表，宣告人類基因組計劃初步完成，這項研究耗時15年，花費了近30億美元[9]。而如今應用最新的HiSeq X 測序平臺，能夠在一天內測序45個人類基因組，并且每個基因組測序僅需1 000美元。相比傳統測序方法有了量的提高和質的飛躍，這將推動更多物種遺傳信息的解密，跨入基因組信息的大數據時代。
目前，高通量測序技術在分子生物學領域的應用包括：全基因組測序 （wholegenome sequencing）[1012]，外顯子組測序 （exome sequencing）[1314]，目標區域測序 （targeted regions sequencing， TRS），未知基因組的從頭測序 （de novo sequencing），總RNA和mRNA測序 （RNASeq），小RNA和非編碼RNA測序[15]，以及表觀基因組學領域的DNA甲基化測序[16]，核糖體圖譜和ChiP測序[17]等，為遺傳信息的揭示和基因表達調控等基礎生物學的研究提供了重要的數據信息[8]。
1.2高通量測序平臺的比較
在過去的10年里，高通量測序技術平臺經歷了不斷的改進，美國Illumina和Roche等生物科技公司相繼推出不同原理、不同應用特性、功能更強大的測序儀，單次測序反應數據量也由2005年的1G增長至1T，提高了1 000倍[18]（表1）。依據測序原理的不同，目前常用的測序方法有連接法測序（sequencing by ligation， SBL）及使用合成法測序 （sequencing by synthesis， SBS）的循環可逆終止法（cyclic reversible termination， CRT）和單核糖核酸增加法（singlenucleotide addition， SNA）[19]。對各大測序平臺比較發現[19]，NGS研究最常用的是Illumina平臺， Illumina的產品覆蓋了從低通量的MiniSeq到超高通量的HiSeq X系列，其中HiSeq X系列最多可以在一年內產生1 800多個30×覆蓋度的人類基因組數據量。目前Illumina測序儀能測得的最長讀長為300 bp，并且運行穩定、數據可靠、性價比高，這些優勢決定了其在短讀長測序上的廣泛應用。Roche 454平臺和Ion Torrent平臺能夠提供較長的讀長，大約為700 bp與400 bp，因而在基因組結構較為復雜的研究上應用相對較多，然而與Illumina平臺相比，其高昂的費用，低通量等缺點限制了它們的廣泛應用。以連接測序法為原理的SOLiD 5500測序平臺能夠測得75 bp的讀長，準確率雖高，但由于讀長太短，運行時間太長等硬傷限定了其實用性。同樣測序原理的華大基因的BGISEQ500平臺，采用探針錨定聚合技術 （cPAS）能夠進行單、雙端測序，提供一站式測序體驗，測得的最長讀長達100 bp，快速、靈活、可拓展是該平臺的優勢。Qiagen的GeneReader是專為臨床診斷設計的，主要應用于腫瘤基因上，應用面較窄（表1）。
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