摘要

甜瓜壞死斑點病毒（Melon necrotic spot virus， MNSV）及瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）近年來在瓜類種植區均大面積發生，危害較為嚴重，已成為制約甜瓜生產的重要因素。本研究廣泛收集疑似感染MNSV及 CCYV的甜瓜病葉，從中提取植物總RNA進行RTPCR擴增，將產物分別連接到pEASYT1 Simple克隆載體上，對含有目的片段的重組子進行測序及比對分析。結果顯示得到了與預期結果一致的DNA序列，其擴增產物大小分別為673 bp（MNSV）和877 bp（CCYV）。同源性分析結果表明，MNSV和CCYV壽光分離物的核苷酸序列與中國其他地區或一些國家已報道的分離物同源性達99%～100%。

關鍵詞

甜瓜壞死斑點病毒；瓜類褪綠黃化病毒；RTPCR；序列分析

中圖分類號：

S 436.5

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.023

Abstract

Melon necrotic spot virus （MNSV） and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） have seriously affected the yield and quality of melons in large melongrowing areas in recent years. In this study， diseased leaves infected by MNSV and CCYV were widely collected from Shouguang， Shandong Province. Total RNA were extracted from these leaf tissues and RTPCR was performed. The PCR products were inserted into pEASYT1 Simple cloning vector， and the expected DNA fragments with the size of 673 bp （MNSV） and 877 bp （CCYV） were sequenced and analyzed by BLAST search in GenBank， respectively. Homology analysis showed that nucleotide sequence of MNSV and CCYV isolates from Shouguang had 99%-100% identity with those isolates from other parts of China or some countries previously reported.

Key words

MNSV；CCYV；RTPCR；sequence analysis

甜瓜（Cucumis melo）是起源于非洲和亞洲熱帶地區的喜溫植物，屬葫蘆科，是我國重要的經濟作物和深受消費者喜愛的水果之一。甜瓜也是山東省壽光市種植面積較大的瓜果品種之一，常年種植達2×103 hm2，其中最有名的是‘玉錦’甜瓜，如今已銷往全國各地。但是近年來，各種病蟲害，尤其是病毒病對甜瓜危害較重，嚴重影響了甜瓜的產量和品質，其中，甜瓜壞死斑點病毒及瓜類褪綠黃化病毒在瓜類作物中大面積發生，嚴重危害了甜瓜等瓜類作物的生長[15]。

甜瓜壞死斑點病毒屬于香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus），除侵染甜瓜外還能夠侵染其他多種葫蘆科植物，如黃瓜、西瓜、絲瓜、葫蘆、南瓜等；其主要通過種子、黃瓜黑頭葉甲、土壤真菌—瓜油壺菌及機械磨擦等進行傳播[6]；瓜類褪綠黃化病毒屬于毛形病毒屬（Crinivirus），主要侵染黃瓜、西瓜、甜瓜等瓜類作物，通過煙粉虱以半持久性方式傳播[7]。

以RTPCR為基礎的分子檢測技術已被廣泛應用于檢測侵染甜瓜以及其他葫蘆科作物的病毒[810]。本研究采用RTPCR檢測了兩種典型癥狀的甜瓜病樣，對于研究壽光以及山東地區甜瓜上病毒的基因結構、流行規律、綜合防治對策和抗病育種均具有重要的意義。

1材料和方法

1.1材料

2013-2014年在山東省壽光市的甜瓜種植區，采集了具有典型MNSV和CCYV癥狀的甜瓜病葉各10份，保存于-80 ℃；兩種病毒的陽性對照由山東農業大學植保學院的竺曉平教授提供。

植物RNA提取試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、2× Taq master mix、PCR產物回收試劑盒等購自北京科百奧生物科技有限公司；pEASYT1 Simple克隆試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2病葉總RNA的提取

分別稱取采集的甜瓜病葉及健康葉片0.3～0.5 g，利用植物RNA提取試劑盒提取其總RNA。

用于檢測MNSV的PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃下繼續延伸10 min。

用于檢測CCYV的PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃下繼續延伸10 min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6PCR產物的回收及克隆

使用PCR產物回收試劑盒快速回收相應的目的片段，并將其分別與pEASYT1 Simple克隆載體連接，連接產物轉入大腸桿菌Trans1T1 感受態細胞中，經菌液PCR鑒定的陽性菌落，送到北京華大基因科技有限公司測序。

1.7序列分析

將測序結果分別在http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi與GenBank中的其他相關基因序列進行相似性比較，并利用DNAstar及MEGA軟件分析各分離株的序列同源性及構建親緣關系的系統發育樹。同源性分析所用到的各病毒分離株基因登錄號、名稱、寄主及其來源地見表1和表2。

2結果與分析

2.1病樣調查結果

在山東省壽光市的甜瓜產區分別采集到代表性的甜瓜病樣，MNSV的田間癥狀主要為葉片上產生許多黃色壞死斑點（俗稱“米黃點”）（圖1a）； CCYV的田間癥狀主要為葉片出現褪綠，但葉脈仍為綠色（圖1b）。

2.2RTPCR檢測

以采集的甜瓜葉片總RNA為模板進行RTPCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，感病樣品的擴增產物大小分別在673 bp（MNSV，圖2）和877 bp（CCYV，圖3），與陽性對照的檢測結果一致，而健康植株沒有得到任何條帶。另外，該法對甜瓜樣品的陽性檢出率分別為60%（MNSV）和80%（CCYV）。

2.3MNSV和CCYV壽光分離物部分序列分析

選擇2個供試甜瓜的PCR產物，分別純化后克隆到pEASYT1 Simple載體，對含有目的片段的重組子進行序列測定，結果表明，MNSV及CCYV壽光分離物的擴增產物分別由673和877個核苷酸組成。

將所得的MNSV壽光分離物（MNSVShouguang）與其他國家或地區分離物核苷酸序列進行比對分析并構建系統發育樹（圖4），發現其與中國的MNSVHM分離物（GU480022.1）同源性最高，達到100%，而與巴拿馬（DQ443546.1）、西班牙（EU848553.1和DQ339157.1）、突尼斯（EF442681.1）和以色列（DQ922807.1）的一些MNSV分離物相似性較高，達到92.2%～93.9%，與日本（AB044292.2、AB189943.1和AB007001.1）、韓國（AB106106.1）及西班牙的Malfa5（AY122286.1）分離物存在著較大的差異，同源性僅為86%～90%，屬于不同的分支。

CCYV壽光分離物的同源性分析結果（圖5）表明，CCYV壽光分離物（CCYVShouguang）的核苷酸序列與寄主同為甜瓜的中國（JQ904629.1和KJ149806.1）、中國臺灣（JF502222.1和JN126046.1）、日本（AB523789.1）的分離物同源性均較高，達到99%，差異較小；而與中國（絲瓜KJ735450.1和西瓜HM581658.1）、蘇丹（黃瓜，JF807053.1）和黎巴嫩（黃瓜，JX014262.1）的分離物雖然感染寄主不同，相似性也較高，達到99%左右，可歸屬為一個大的分支；與伊朗分離物（KC577202.1）核苷酸序列相似性為94.5%，存在一定的差異。

3討論

甜瓜壞死斑點病毒病和瓜類褪綠黃化病毒病是近幾年在甜瓜上發現的兩種比較新的病害。隨著甜瓜栽培規模和范圍的不斷擴大，以及設施園藝的推廣利用，這兩種病毒病的發生范圍越來越廣泛，危害程度日趨嚴重，尋找有效快捷的檢測方法十分必要。雖然這兩種病毒的生物學特性、病毒結構及傳播媒介等各不相同，但在大田，尤其保護地種植條件下，兩種病毒往往會交替發生，或者對植株造成復合侵染，故將其放在一起進行調查和研究。為了明確供試甜瓜樣品感染的病毒種類，本研究分別對各樣品進行了MNSV和CCYV的RTPCR檢測，基本上排除了兩種病毒復合侵染的情況；但在實際生產中復合侵染的現象不容忽視，這也是下一步研究需要關注的問題。

MNSV和CCYV壽光分離物的同源性分析結果表明，其與Gu等[34]報道的中國其他地區的病毒分離物相似性達99%以上，可以推測分別為同一種病毒；MNSV壽光分離物與日本、韓國及西班牙Malfa5分離物的同源性較小，存在著較大的差異，該結論與溫少華[8]的研究結果一致；CCYV雖然能夠侵染不同的葫蘆科作物，但包括壽光分離物在內的各分離物并沒有出現基因變異，表現出良好的同源性，整個系統發育樹顯示CCYV壽光分離物與各地分離物的親緣關系較近，并未受地緣關系的太大影響。

由MNSV引起的葉片黃色壞死斑點類似于細菌性角斑病的淺黃色斑點，而CCYV引起的葉片褪綠黃化癥狀與植株缺素癥狀非常相似，在生產上很容易造成誤診誤治，如不及時重點防治，必定造成嚴重的經濟損失。劉珊珊等[9]、Gu等[3]通過RTPCR對河南省和湖南省瓜類褪綠黃化病毒進行了分子鑒定，溫少華[8]也對MNSV中國分離物進行了鑒定和序列分析。本研究中甜瓜樣品的PCR檢測結果，基本與外觀表現的感病癥狀一致，但也發現了疑似感病并未顯示陽性的情況，或許是采樣時的診斷失誤或樣品中病毒含量較低造成的，這在田間病樣的大量檢測中很難避免。因此，建立高效快速的RTPCR檢測體系，能有效地監測與控制病毒病的發生及蔓延，為建立早期病毒防控預警技術提供技術支持。

參考文獻

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[8]溫少華. 甜瓜壞死斑點病毒MNSV中國分離物全基因組序列的克隆和分析[D]. 武漢： 華中農業大學， 2009.

[9]劉珊珊， 彭斌， 吳會杰， 等， 海南省和河南省發生甜瓜褪綠黃化病的分子鑒定[J]. 果樹學報， 2013， 30（2）： 291293.

[10]李淑菊， 王惠哲， 霍振榮， 等.利用 RTPCR 對黃瓜病毒病毒原種類進行檢測[J].華北農學報， 2004， 19（3）： 100102.

（責任編輯：楊明麗）

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