摘 要：為了對雞致病性大腸桿菌的流行情況及耐藥性調查分析，從河南省部分地區的雞場的典型大腸桿菌病病變的病、死雞中采集了118份內臟病料，結合培養特性對其進行了細菌的分離和生化鑒定，結果分離到大腸桿菌99株，其中致病性大腸桿菌76株。對這76株致病性大腸桿菌進行了8種抗生素敏感性試驗，發現分離的菌株對8種藥物均有不同程度的耐藥性，四環素抑制作用最弱，丁胺卡那霉素抑制作用最強。63.2%為高度敏感，25%中度敏感，表明該藥對雞大腸桿菌是有顯著的效果；其中，諾氟沙星(55.3%)，也有良好的抑制作用。

關鍵詞：雞 致病性大腸桿菌 細菌 耐藥性

雞大腸桿菌是雞最常見的病原菌之一，可引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、輸卵管炎和滑膜炎、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、眼炎等一系列病癥[1]。隨著集約化的程度提高，飼養規模的不斷擴大，雞大腸桿菌病的流行勢頭也愈加猛烈；繼發感染其他疾病或混合感染，致許多傳染病的發病率和死亡率明顯升高，以及大量的藥物，疫苗和人工費用的支出，給養雞業造成嚴重的經濟損失，其中大腸桿菌病已居雞細菌性疾病之首，占33%[2]。近年來變異株出現，且極易產生的耐藥性，抗菌藥在臨床和生產中的廣泛應用，特別是不規范使用、濫用，導致了細菌的耐藥性的產生和擴散。在臨床疾病防治工作中，要取得較好的治療效果，需要選擇對細菌比較敏感的藥物來進行預防和治療，達到有效控制疾病的目的。在生產實踐中，用藥敏實驗對雞致病性大腸桿菌進行耐藥性檢查，篩選出高敏藥物，對雞大腸桿菌的治療具有重要意義。為此，我們從采集的多份病料中進行大腸桿菌的分離，鑒定并進行了耐藥性檢測和分析。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 2006年7月至10月從河南的新鄭、中牟、滎陽等部分地區的雞場的典型大腸桿菌病病變的病、死雞采集的病料，在河南農業大學禽病研究所進分離、鑒定、保存及耐藥性檢測。

1.1.2培養基 營養瓊脂、伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂等購自北京奧博星生物技術責任有限公司（060527），按照說明書要求配制；檸檬酸鹽、三糖鐵（TSI）等培養基按文獻[3]配制。葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖微量生化鑒定管由上海市醫學化驗所制劑廠生產（051219）。

1.1.3試劑 革蘭氏染色液、V-P、M-R、吲哚等試劑按照文獻[3]配制。

1.1.4試驗動物 1周齡健康雛雞由河南農大孵化廠提供。

1.1.5藥敏試驗紙片氯霉素（30µg/片）、鏈霉素（10µg/片）、紅霉素（15µg/片）、四環素（30µg/片）、慶大霉素（10µg/片）、諾氟沙星（10µg/片）、卡那霉素（30µg/片）、丁胺卡那霉素（30µg/片）購于北京天壇藥物生物技術開發公司（060811）。

1.2方法

1.2.1形態觀察 將采集（心、肝）病料直接涂片，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2病原菌的分離培養 采用無菌操作取病雞的心臟、肝臟，用滅菌的接種環，將病料接種于營養瓊脂上，37°C，培養18~24h，選取可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢并分離培養。取可疑菌落劃線接種于麥康凱培養基，37°C，培養18~24h；挑取麥康凱培養基上的單個典型接種于伊紅美藍培養基上，37°C，培養18~24h；挑取在伊紅美藍培養基上的暗紫紅色或紫黑色具有金屬光澤的單個菌落，接種到營養肉湯進行增菌純培養，4°C保存備用。

1.2.3生化鑒定 按常規方法進行三糖鐵（TSI）實驗、糖發酵、吲哚、MR和VP等生化發酵實驗。并用標準菌株作參照，對其進行生化鑒定。

1.2.4致病性試驗 所有易感雞均由河南農大種雞廠提供，按照文獻報道方法[4，5]進行，以每個受試菌株的LB肉湯培養物（每ml約含107CFU）離心后，氣管接種1周齡易感雞，每羽0.2ml；另設一組為對照（6羽），每只注射0.2ml的LB肉湯，每天上、下午各觀察一次記錄雞的死亡數、病變，并以心血作細菌的分離及鑒定，觀察期為7d，7d后對仍然存活的雞進行撲殺，觀察病變并做細菌的分離鑒定。根據雞的死亡數和病變程度確定分離株的致病性，標準如下：（1）高致病株：50%以上的雞死亡或產生嚴重的病變（心包炎、肝周炎、氣囊炎，肝壞死等）；（2）中等致病株：接種雞不死亡，產生嚴重病變者不超過50%；（3）低致病性分離株，接種雞不死亡，僅在氣囊上偶爾產生病變。

1.2.5藥敏試驗 （見表1）按照WHO推薦的Kirby-bauer瓊脂擴散法操作根據抑菌環的大小，判定10種藥敏紙片對各個菌的抑菌效果。

表1 藥敏紙片的種類及判定標準

藥物每片

含藥量判定標準——直徑（mm）

耐藥（R）中敏（M）敏感（S）

氯霉素30≤1213~17≥18

鏈霉素10≤1112~14≥15

紅霉素15≤1314~17≥18

四環素30≤1415~18≥19

慶大霉素10≤1213~14≥15

諾氟沙星10≤1516~20≥21

卡那霉素30≤1314~17≥18

丁胺卡那霉素30≤1415~16≥17

2 結果

2.1分離菌形態

分離菌為革蘭氏陰性菌，小桿狀，兩端鈍圓，大小在1.5µm左右，散在，不運動。

2.2培養特性

在營養瓊脂平板上生長時為微小菌落，邊緣整齊，中央隆起，光滑，透明，無色，圓形；在麥康凱瓊脂平板上生長，中等菌落，中央輕微突起，邊緣整齊，光滑，紅色，圓形；在伊紅美藍瓊脂平板上生長時為暗紫紅色或紫黑色小菌落，周圍帶有綠色金屬光澤；在營養肉湯中生長時可見均勻混濁，底部有灰白色沉淀，輕搖試管，沉淀呈絮狀升起。

2.3分離菌的生化特性

分離的99株大腸桿菌的生化試驗結果符合大腸埃希氏菌的特征：能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產生氣泡，不分解尿素，不產生硫化氫，吲哚試驗和MR試驗均為陽性，VP試驗和枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性[6]。結果見表2：

表2 大腸桿菌的生化鑒定結果

項目呈陽性反應的菌株數陽性菌株所占比例

葡萄糖99100%

H2S00

乳糖9292.9%

吲哚試驗99100%

麥芽糖9697.0%

MR試驗9899.0%

蔗糖1111.1%

VP試驗00

甘露醇99100%

枸櫞酸鹽利用試驗00

尿素00

TSI試驗9494.9%

2.4致病性試驗

99株大腸桿菌氣管接種健康雛雞后，7d內試驗組雛雞全部死亡，且從死亡雞心、肝回收到接種菌共分離致病菌株76株，占76.8%（76/99）；對照組雛雞全部存活。接種雞主要表現精神沉郁，呼吸困難，喘氣垂翅，豎毛，縮頸，飲食欲下降或廢絕。病雞死亡率高在12~24h，此間病死雞眼觀病變主要為心包積液，氣囊混濁和肝臟腫大，淤血。典型病變出現于接種后48h死亡雞，可見纖維素性心包炎，肝周炎，氣囊上可見多量干酪樣滲出物；病程越長，病變越典型。

2.5藥敏試驗

對76株分離得到的大腸桿菌進行了8種抗生素的藥物敏感試驗，結果8種抗生素均產生了不同程度的耐藥性。尤其是四環素（K）89.5%耐藥，8種抗生素抑菌作用最強的是丁胺卡那霉素（AK），敏感菌株占63.2%；其次為諾氟沙星，敏感菌株占55.3%，具體結果見表3：

表3 76株大腸桿菌藥敏試驗結果

藥物耐藥（R）敏感度（M）高度敏感（S）

株數百分率株數百分率株數百分率

氯霉素3444.7%67.9%3647.4%

鏈霉素5369.7%1519.7%710.5%

紅霉素6686.8%45.3%67.9%

四環素6889.5%810.5%00

慶大霉素4863.2%79.2%2127.6%

氟哌酸2228.9%1215.8%4255.3%

卡那霉素2836.8%1722.4%3140.8%

丁胺卡

那霉素911.8%1925%4863.2%

3 討論與分析

1）根據剖檢病理變化、菌體形態特性、染色特性、生化試驗和伊紅美藍鑒別培養基方面試驗結果，可確定99株均為大腸桿菌。

2）根據致病性試驗和生化試驗結果表明，所分離99株中致病菌有76株占分離菌總數的76.8%，說明本地的致病性大腸桿菌的分離率很高。

3）大腸桿菌耐藥產生的原因及防治對策：禽類大腸桿菌病是規模化雞場的常發病，它可以通過許多途徑將耐藥性傳遞給其它埃希氏菌，所以大腸桿菌抗藥性形成較快，環境中大腸桿菌的耐藥性菌株越來越多[7]。從藥敏試驗來看，雞致病性大腸桿菌對抗生素的耐藥性以多重耐藥為主。主要是與下列幾種因素有關：（1）雞場長期飼喂含有多種抗生素的飼料；（2）盲目地投放藥物；（3）用藥過程中選藥，劑量療程不當；（4）獸藥生產市場存在一定的質量問題；（5）由于獸藥名稱商品化，實為同類藥物卻商品名不同，加之飼養者的疏忽，導致大量長期使用同種藥物；（6）抗菌藥物強大的壓力下，細菌本身發生了變異。細菌的耐藥性通過介導在細菌間傳播和擴散[8]。一些曾經的特效藥，現在也失去了價值。因此，規模化雞場應予以足夠的重視，每半年進行一次抽樣藥敏試驗，選擇最有效的藥物來控制和治療此類疾病。

4）藥敏試驗的啟示：從本次試驗結果來看，對8種抗生素進行試驗，對大腸桿菌敏感率達到50%以上的藥物只有丁胺卡那霉素、諾氟沙星，對大腸桿菌病有一定的參考價值，臨床用上述幾種藥物可以達到比較好的效果。同時本試驗也表明雞場雞群所感染的大腸桿菌已對多數常用藥物產生了耐藥性，而且對青霉素類藥物產生的耐藥性尤其明顯，這與雞場長期使用該類藥物有關。隨著耐藥菌株的日益增多，抗生素對大腸桿菌的防治效果越來越差，而且現在藥物用量也越來越大，最后會導致藥物殘留，從而影響家禽產品質量，威脅人類的健康。因此，加強生物安全措施，合理使用疫苗，選擇有效的抗生素，才是控制大腸桿菌最經濟有效的方法。

參考文獻：

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[8]趙靜，楊漢春.規模化豬大腸桿菌對耐藥性的檢測[J].中國獸醫雜志1998，24（1）：12～13.

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