材料，對日本鳶尾的根、莖、葉等部位的內生真菌進行系統的分離和類群鑒定分析，以期不斷地豐富內生真菌資源，為開發利用藥用植物內生真菌提供基礎。

1 材料與方法

1.1  材料

1.1.1  樣品采集  日本鳶尾采自湖南師范大學醫學院院內中藥園，經本院藥用植物教研室趙冰清教授鑒定后，采集其根、莖、葉，將樣本存放在冰盒中運送回實驗室中，保證其處于低溫干燥的環境中。5 h內對采集樣本進行處理，進行內生真菌的初步分離[9]。

1.1.2  培養基  馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

1.1.3  主要儀器與設備  BSG-4生物安全柜（造鑫企業有限公司）;SHP-250生化培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）;LD2X-50FA立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）;101-2AB電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;ZD-85氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫療儀器廠）;SIGMA 3K3OH冷凍高速離心機（德國SIGMA公司）;G：BOXF3電泳凝膠成像分析儀（基因有限公司）;ABI2720 PCR儀（美國ABI公司）;超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）;國之源純水器（湖南科爾頓水務有限公司）;瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）;普通光學顯微鏡（日本Olympus公司）;倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.1.4  試劑  HP真菌DNA小量抽提試劑盒（OMEGA公司）;核酸染色劑（北京索萊寶科技有限公司）;RNase A（MP生物醫學公司）;2×Taq預混PCR反應體系（北京康潤生物科技有限公司）;瓊脂糖（BioFroxx公司）;5×TBE、通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（上海生工生物工程公司）;500 bpDNA Ladder（天根生化科技有限公司）;分析純次氯酸鈉、無水乙醇、β-巰基乙醇、三氯甲烷、異丙醇（上海國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  日本鳶尾內生真菌的分離  日本鳶尾的根、莖、葉先用自來水洗去表面泥漬，最后用無菌水沖洗一遍，再放入培養皿內鋪平晾干后在超凈工作臺內進行嚴格的表面消毒[10]：75%乙醇1 min、次氯酸鈉溶液（3%～5%有效氯）3 min、75%乙醇0.5 min，后用無菌水沖洗4遍，采用兩種對照試驗來進行消毒效果檢測[11-12]：一是漂洗液檢測法，把最后一遍沖洗水涂布在PDA培養基上，放置于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d;二是組織印跡法，將已經滅菌的根莖葉分別壓入PDA培養基中，使樣品與培養基緊密接觸20 min，接著移去滅菌植物樣品，將培養基同樣放置在28 ℃恒溫培養箱中培養7 d。對消毒好的樣品晾干，在超凈工作臺中用無菌剪刀將根莖葉分別剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的小組織塊，均勻的平鋪在PDA平板中，同時做好標記，28 ℃恒溫培養1～2周，待菌落長出后根據菌落特征的不同再來進行分離，最后將完全純化的內生真菌保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2  內生真菌的形態學鑒定  通過傳統的形態學鑒定方法，參照相關真菌書籍對分離得到的內生真菌進行鑒定[13-14]：主要從菌落的大小、顏色、質地等肉眼特征和孢子的顏色、形狀、產孢結構類型、孢子大小等顯微特征進行初步判斷和分類。

1.2.3  內生真菌的分子生物學鑒定 將分離培養好的內生真菌接種到含有50 mL PDB的錐形瓶中，每種接種4瓶。26 ℃，180 r/min振蕩培養2～7 d，待其發酵渾濁后離心取其沉淀，將沉淀放入50 ℃烘箱中過夜干燥備用。稱取10～50 mg的干燥沉淀至事先已滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨后轉入1.5 mL的離心管。按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取真菌DNA。將所提DNA放置于-20 ℃條件下備用。利用真菌ITS1與ITS4通用引物（委托上海生工生物工程公司合成）對提取的DNA產物進行PCR擴增[14]，反應體系20 μL∶7 μL ddH2O、10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye、1 μL正向引物、1 μL反向引物、1 μL DNA模板。PCR擴增反應條件：預變性94 ℃，3 min;變性94 ℃，30 s;退火55 ℃，30 s;延伸72 ℃，1 min。共30個循環后，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下500 bp處有明顯條帶出現。最后委托湖南省擎科生物技術有限公司進行測序，測序后將真菌ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST（http：//blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）比對，來獲得所提內生真菌的分子生物學鑒定信息。

2 結果

2.1  消毒效果的檢測

把最后一遍沖洗水涂布在PDA培養基上，放置于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d，無菌落長出。同時將已經滅菌的根莖葉壓入PDA培養基中，使樣品與培養基緊密接觸20 min，移去滅菌植物樣品，同樣放置在28 ℃恒溫培養箱中培養7 d也未觀察到真菌生長。以上結果充分證明，經過嚴格的表面消毒程序后，附著在植物表面的菌類已經被徹底消除，分離得到的菌株來自于植物體內部，屬于內生真菌。

2.2  日本鳶尾內生真菌的分布和分子生物學鑒定結果

從日本鳶尾的根、莖、葉中共分離純化出5種20株內生真菌，分別為橘青霉、尖孢鐮刀菌、肉色隔孢伏革菌、首都葉點酶（有性形為球座菌屬（Guignardia））和小新殼梭孢菌。菌落特征和顯微特征描述見表1，分子鑒定結果見表2。通過基于測序結果將內生真菌ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對后，收集同源性比較高的比對序列，通過鄰接法構建系統發育樹，其同源性分別是：R1為100%;R2為100%;R3為84%，R4為87%;R5為64%。R1代表根4B和葉1D2的ITS序列，R2代表根2D和根5B的的ITS序列，R3代表葉2A1的ITS序列，R4代表莖2E的ITS序列，R5代表葉2A2的ITS序列。結果表明其同源性都大于50%，根據系統進化樹原理[16]，ITS同源性支持形態學上R1、R2、R3、R4和R5菌株分別鑒定為橘青霉、尖孢鐮刀菌、肉色隔孢伏革菌、小新殼梭孢菌和首都葉點酶。因為植物內生真菌在培養過程中受外在條件的影響易發生變異，因此，需綜合考慮來對其進行分類鑒定。

3 討論

通過形態學以及分子生物學鑒定方法的研究表明：日本鳶尾的根、莖、葉中都存在一定量的內生真菌，并且在植物的組織部位上及內生真菌的屬別上均體現出一定的專一性，這可能是由于內生真菌受宿主植物不同組織部位微環境差異的影響，如光照強度、濕度、氣溫變化等的影響[17]，同時不同組織中也含有共同的菌群，表明內生真菌在組織分布上既具有差異性又具有共同性。研究表明內生真菌自身也能產生各種類型的生物活性物質，而且很多內生真菌可能也帶有植物體的酶系，具有與宿主相同或類似生理活性的次級代謝產物，與宿主長期地共同進化并產生協同作用[18]。姚裕群等人對越南槐中內生真菌的多樣性、抑菌活性及其次生代謝產物研究發現其抗菌資源豐富，多個菌株顯示了與宿主相似的強抑菌活性，對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等人體病原菌具有明顯的抑制作用[6]，有學者從藥用植物鴉膽子的根、莖、葉和果實中共分離出83株內生真菌，且擬莖點霉屬中的菌株YJ-17對靶向微生物具有較好的抑制作用[7]。今后我們將進一步開展日本鳶尾內生真菌次級代謝產物及其生物活性的研究。

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