摘要：枇杷同其他木本果樹一樣，遺傳上是高度雜合的，因此，獲得真雜種是進行雜交育種等遺傳改良的重要基礎工作。以我國的特早熟優質枇杷品種早鐘6號作母本，分別以西班牙的3個大果型品種作父本進行種內雜交；并以櫟葉枇杷為母本與普通枇杷的解放鐘作父本進行遠緣雜交，4個雜交組合(ZJ、ZU、zP和Li)共獲得493株雜種苗。運用RAPD分子標記，對這些雜交苗進行早期雜種鑒定，根據有無父本的特征帶或新帶型來鑒定其是否雜交成功，4個組合從100條RAPD引物中共計篩選出9條具有父本特征帶的引物，鑒定454株雜種苗為真雜種。試驗獲得的真雜種苗可為枇杷品種的選育提供重要資源。

關鍵詞：枇杷：RAPD；雜種鑒定

中圖分類號：S667.3

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980f2010103-385-06

許多果樹在雜交選育新品種時常常因品種間串粉、去雄或套袋不及時等因素，造成真假雜種苗混雜。在實際工作中可以利用形態學、細胞學以及分子標記等方法進行雜種苗的鑒定。每種方法各有其優缺點。形態學標記的主要缺點是易受環境條件和發育狀態的影響：細胞學鑒定雜種工作量大，也比較煩瑣；分子標記技術的發展，為我們提供了從DNA水平即基因水平上來檢測種子純度的有利工具，最終通過電泳圖譜檢測差異性，其多態性強，準確性高。RAPD標記為顯性，對雜種的鑒定可以根據有無父本的特征帶或在雜交后代中出現雙親所不具有的條帶(即新帶型)鑒定其是否雜交成功I引。根據孟德爾遺傳規律，理論上每個標記只能鑒定出50％的雜種，這樣標記Ⅰ(50％)十標記Ⅱ(25％)+標記Ⅲ(12.5％)+標記Ⅳ(6.25％)=93.75％，4個標記便可將F₁代群體中93.75％的雜種鑒定出來。由于RAPD的顯性遺傳特點，在用雙親進行引物篩選時無法判斷父本特征位點是否為純合位點，有可能出現母本的顯性位點，故分析時必須結合多個RAPD標記(不少于3個)進行分析。新帶型是在雜交后代中出現而在雙親中均沒有的條帶，在真假雜種鑒定時我們直接判斷其為真雜種。

宋愛云等利用RAPD技術對香樟6個優選株和2個普通株的遺傳多樣性進行了分析，確定了它們的遺傳關系。劉靜等綜述了分子標記技術在石斛屬植物中的應用研究，認為RAPD是研究石斛屬植物的遺傳多樣性真偽的有效方法。Graham等在分析英、美、荷蘭等國家不同育種草莓組培苗時提出：親本的選配要選擇遺傳距離較大的材料，才有利于體現雜交優勢。RAPD標記被認為是進行枇杷雜種鑒定的一種簡單、快速有效的方法。

枇杷屬于薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya)，種質資源豐富，原產我國的枇杷屬植物有21個種(包括5個變種或變型)，栽培品種的枇杷為普通枇杷(E.japonica Lindl.)，經過長期栽培馴化及選育，形成了許多各具特色的品種。世界上幾個主要的枇杷生產規模較大或科研較先進的國家，在品種資源上形成了各自的特色。中國的枇杷品種資源最豐富，有黃肉品種200多個和白肉品種100多個；日本主要是黃肉枇杷品種，不足100個品種，然而雜交育成的品種占有較大比例，品質較好：西班牙也主要是黃肉品種，也不足100個，但西班牙有若干個果實較大的品種，其中3個品種的平均單果質量都超過90g，其大果性在國際枇杷上獨占鰲頭。

我們選用我國特早熟優質的早鐘6號枇杷和3個大果型西班牙品種雜交，以及用櫟葉枇杷和普通枇杷中的解放鐘進行遠緣雜交，共獲得4個雜交組合(ZJ、ZU、ZP和Lj)，共計有493株雜種苗，采用RAPD標記對這些雜種苗進行早期鑒定。研究在聚合不同國家枇杷品種的優良特性方面，在遠緣雜交創造新種質方面：以及在利用分子標記早期鑒定雜種以期提高枇杷雜交育種的效率等方面，都具有重要意義。

1　材料和方法

1.1　材料

2004年12月份進行了普通枇杷種內的3個組合的雜交和櫟葉枇杷×普通枇杷1個組合的雜交，雜交按常規方法進行。次春收獲種子播種獲得雜種苗。雜交的3個群體即早鐘6號×西班牙品種Javierin(ZJ)雜種苗共計202株、早鐘6號xUllera(ZU)雜種苗共計94株、早鐘6號xPeHuches(ZP)雜種苗共計83株、櫟葉枇杷×解放鐘(Li)雜種苗共計114株。

1.2　方法

1.2.1　雜交實驗　雜交選取枇杷盛花期含苞待放的花蕾，每穗留花10-15朵，去除雄蕊，將收集的父本的花粉點在母本的柱頭上，授粉后用雙層紙袋隔離，待幼果成型去掉外面一層，里面一層保留至果實成熟。

1.2.2　枇杷基因組DNA的提取枇杷基因組DNA的提取參照劉月學等…J和喬燕春等的方法。

1.2.3　RAPD體系和擴增程序參照楊向暉和吳錦程等㈣的方法，25μL的反應體系中，Mg²⁺為2.0mmol·L^-1，酶為1.0U，引物為0.2μmol·L^-1，dNTPS為0.10mmol·L^-1；擴增程序為：94℃5min(預變性)；94℃40s(變性)→38℃1 min(復性)→72℃1min(延伸)(45個循環)；72℃10min(后延伸)。

2　結果9分析

2.1　RAPD引物篩選

實驗隨機選取100條能在枇杷上擴增產生多態性的RAPD引物，進一步對早鐘6號、Javierin、Pel-luches、Ullera、櫟葉枇杷和解放鐘6個親本的基因組DNA進行擴增，經3次重復，篩選出能在Javierin、Pelluches、Ullera和解放鐘4個父本中穩定擴增的特征帶共計9條引物，引物序列見表1。

2.2　4個組合RAPD擴增圖樣

2.2.1　早鐘6號~Javierin F，代群體鑒定　從100條RAPD引物中篩選出具有父本Javienn特征帶的引物，分別為G16、AB04、AVl9、BC20和BE02，進一步對202株早鐘6號和Javiefin的雜交后代進行擴增，最后有28株雜交苗無法確定是否為真雜種：其余的鑒定為真雜種，真雜種率為86.2％。圖1和圖2分別是引物G16和AB04的部分擴增結果。經重復實驗，獲得的結果穩定可靠，可以作為鑒定真雜種的依據。

2.2.2　早鐘6號×Ullera F₁代群體鑒定

從100條RAPD引物中篩選出具有父本Ullera特征帶的引物AC06、G16、AB04、AVl9、BC20對94株早鐘6號和Ullera的雜交后代進行了擴增，最后有9株雜交苗無6號和Pelluches的雜交后代進行擴增，編號為6的雜交苗無法確定是否為真雜種：在擴增的譜帶中還發現雙親都沒有，而在后代66號和68號中出現的

新帶型，在雜種鑒定中，新帶型的出現更能直觀反映真雜種的鑒定情況，但這類帶型出現的幾率較小，不能作為真雜種鑒定的主要研究手段。結合父本特征帶和新帶型的結果，真雜種率為98.8％。圖4是AC06的鑒定情況。經重復實驗，結果可靠。

2.2.4　櫟葉×解放鐘F₁代群體鑒定　櫟葉枇杷和解放鐘雜交組合為種間雜交，親本之間差異較大，篩選父本解放鐘的特征帶較為容易，本研究僅篩選20條引物，獲得具父本特征帶的引物F05、F06，且這2個引物擴增獲得的父本特征帶均為純合顯性位點即AA型，AA型的位點是進行雜種鑒定最為理想的位點，這類型位點在親緣關系較遠的親本間出現頻率較高，圖5為引物F05對114株Lj組合雜交后代的鑒定情況，圖中可以看出，引物F05在父本解放鐘中有多個位點為純合顯性位點，經重復試驗，結果穩定可靠，進一步利用引物F06進行擴增，獲得的鑒定結果較為一致。114株雜交苗均為真雜種，真雜種率為100％。

3　討論

常規雜種鑒定有形態學鑒定和細胞學鑒定等方法，陳志堅等利用錘度具有高度可遺傳的品質特性，對22個甘蔗家系F₁群體材料進行了雜種鑒定。然而木本果樹童期長，雜種后代幼苗在形態上很難區分；利用細胞學鑒定，雜交后代的染色體數目相同不能直接識別，通過基因組原位雜交技術可以進一步解決，陳春麗等利用基因組原位雜交技術對屬間雜種枳橙進行了有效的鑒定。盡管原位雜交技術獲得的實驗結果較為直觀，但耗時較長，花費較高，不適于大量材料的雜種鑒定。由于RAPD分子標記具有遺傳穩定，不受環境變化、發育階段和組織器官的影響，具有較高的穩定性、而且操作簡便，近年來RAPD分子標記技術廣泛應用在許多作物的雜種鑒定中，欒雨時等利用RAPD分子標記鑒定了番茄雜種的純度，獲得的結果可快速的應在番茄育種中。本試驗利用RAPD技術對3組種內雜種和l組種問雜種的雜交苗進行了早期鑒定，檢測的方法主要是父本遺傳信息滲入到后代中，或存后代中出現新帶型(雜交后代中有而雙親無的帶型)，我們就可斷定此F，代單株為雜種實生苗。南于RAPD的顯性遺傳特點，在用雙親進行引物篩選時無法判斷父本特征位點是否為純合位點，故分析時必須結合多個RAPD標記(一般為3～5個)進行綜合分析。父本特征帶的基因型為AA或者Aa時，特征帶在后代中出現分離則可判斷其為Aa，不出現分離則為AA。用AA型的父本特征帶進行真假雜種鑒定，可以達到只用一個引物就可以鑒定出所有真假雜種的效果，如櫟葉和解放鐘雜交群體用引物F05就可以將114株雜種鑒定出來。而在雜交后代中出現新帶型的機率并不高，因此鑒定雜種是否為真雜種主要以出現父本的特征帶為主，一旦出現雜交后代有而雙親無的特征帶，我們直接判斷其為真雜種。

本研究結果對于枇杷遺傳改良具有多方面的意義。首先，利用RAPD分子標記技術可以對枇杷種內雜交和種間雜交進行早期快速鑒定和識別，是枇杷雜交育種的有效輔助手段；第二，枇杷樹體較大，種植雜種苗需要很多的土地。利用有限的土地種植真正的雜種苗，既提高效率又節約土地；第三，鑒別出真正的雜種苗，可以為創建枇杷分子遺傳圖譜的作圖群體，提供可靠的基礎。關于創建枇杷分子遺傳圖譜的結果另文報道。

4　結論

利用RAPD分子標記技術，對4個雜交組合(ZJ、ZU、ZP和Li)獲得的493株雜種苗進行了早期雜種鑒定。從100條RAPD引物中共計篩選出9條具有父本特征帶的引物，鑒定出真雜種苗454株。本研究利用西班牙的大果型枇杷和我國選育的優質早熟的早鐘6號枇杷雜交，以期獲得適合我國栽培的優質早熟的大果型枇杷品種：利用野生櫟葉枇杷和解放鐘枇杷雜交，使野生資源中的優異基因源向栽培品種轉化，進而獲得抗逆性強的栽培品種。本試驗獲得的真雜種苗為進一步枇杷品種的選育提供重要資源。

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