基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定，第 1 節(jié)：蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的分析一般可分為四類分析方法：（i）快速而簡(jiǎn)單的分析方法，用于從復(fù)雜混合物中純化少量蛋白質(zhì)；（ii）快速而靈敏的方法，可從目標(biāo)蛋白質(zhì)中獲取少量但足夠的結(jié)構(gòu)信息 （iii）獲取拓展的蛋白質(zhì)或 DNA 序列數(shù)據(jù)庫，以及（iv）能夠通過計(jì)算機(jī)算法將DNA 序列信息與各種類型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息結(jié)合起來，例如 N 末端蛋白質(zhì)或內(nèi)部肽序列，氨基酸組成，肽質(zhì)量指紋圖，MS 片段圖譜或所選肽的序列標(biāo)簽。
高分辨率凝膠電泳（2-D 凝膠電泳是目前最有效的蛋白質(zhì)分離方法），自 70 年代后期就已經(jīng)被用作分析工具。但一直到蛋白質(zhì)樣品制備方法和測(cè)序工具得到了相當(dāng)大的改進(jìn)之后，二維凝膠電泳才發(fā)展成為制備性的蛋白質(zhì)純化程序。蛋白質(zhì)能夠通過電印跡法轉(zhuǎn)到化學(xué)惰性的膜上，可能是蛋白質(zhì)微量樣品制備中最重要的步驟之一，因?yàn)樗鼘⒏叻直媛誓z電泳（純化步驟）和氣體色譜（分析步驟）直接聯(lián)系在了一起。電印跡法又可以結(jié)合基于膜的埃德曼化學(xué)法形成 N 末端或內(nèi)部肽序列。這種組合技術(shù)現(xiàn)在通常稱為微測(cè)序，因?yàn)榕c早期技術(shù)相比，它使樣品制備的靈敏度提高了至少 100 倍，從而可以分析低至 pmole 或 μg 級(jí)別的蛋白質(zhì)。這項(xiàng)技術(shù)在 80 年代后期開始流行，當(dāng)時(shí)聚二氟乙烯（PVDF）印跡膜已經(jīng)成功商業(yè)化。同一時(shí)期，第一個(gè) 2-D 凝膠蛋白序列數(shù)據(jù)庫（實(shí)際蛋白質(zhì)組學(xué)的祖先）也誕生了。但是，由于當(dāng)時(shí)已知的蛋白質(zhì)或 DNA序列數(shù)量很少，這些數(shù)據(jù)庫中的信息非常有限。因此，微測(cè)序法更常被用作 cDNA 克隆的起始點(diǎn)，而不是用于通過同源性進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
隨著蛋白質(zhì)，DNA 和表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等數(shù)據(jù)庫信息在 90 年代以來的迅速增長(zhǎng)。從頭測(cè)序變得不再那么常見，而重測(cè)序或通過比較法進(jìn)行測(cè)序變得更加重要。這是生物質(zhì)譜（MS）技術(shù)進(jìn)入測(cè)序領(lǐng)域的正確時(shí)機(jī)。質(zhì)譜 MS 是非常快速靈敏的技術(shù)方法，即使到了現(xiàn)在，MS 技術(shù)的分析速度和靈敏度仍未達(dá)到其極限。MS 技術(shù)的兩大主要領(lǐng)域是：基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間（MALDI-TOF）質(zhì)譜和電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜，這兩種方法的區(qū)別在于其電離分析物的方法，相關(guān)的樣品制備程序也不同。因此 ESI 主要與液相色譜儀器相結(jié)合，而 MALDI-TOF更適合于高通量檢測(cè)，更適合于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。隨著快速蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的發(fā)展，對(duì)高度可重復(fù)的，可比較的，大規(guī)模二維凝膠電泳方法的需求穩(wěn)步增長(zhǎng)，也通過引入可固定的pH 梯度法得以實(shí)現(xiàn)。
最后，還需要將所有的數(shù)據(jù)結(jié)合起來。氨基酸序列，肽質(zhì)量指紋或肽 MS 片段數(shù)據(jù)需要被翻譯為帶注釋或無注釋基因組序列數(shù)據(jù)庫中的 DNA 序列。每個(gè) DNA 序列可以從兩端和三個(gè)不同的開放閱讀框進(jìn)行讀取。在某些表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，使得搜索變得困難。而計(jì)算機(jī)算法可以成功地解決遇到的這些挑戰(zhàn)，可以匹配到最接近 MS 分析獲取的結(jié)構(gòu)信息對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)或 DNA 序列片段。
基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定系列總結(jié)，將主要集中在兩個(gè)部分：（i）如何從凝膠純化的蛋白質(zhì)樣品中獲得必要的結(jié)構(gòu)信息，（ii）以及如何使用此類信息鑒定蛋白質(zhì)。第 2 節(jié)簡(jiǎn)要介紹了基于常規(guī)Edman 的 N 末端或內(nèi)部肽測(cè)序的方法。
在第二部分中，我們重點(diǎn)介紹基于 MALDI-TOF 的蛋白質(zhì)分析方法，并簡(jiǎn)要回顧將 MS 生成的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的序列進(jìn)行匹配的算法。
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文獻(xiàn)參考：Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000.
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