指導，漢語詞語，讀音為zhǐdǎo，意思是指示教導、指點引導；指導學生實習，也指體育運動的教練員。出自《漢紀·宣帝紀一》， 以下是為大家整理的關于方法學驗證指導原則4篇 , 供大家參考選擇。

方法學驗證指導原則4篇

第一篇: 方法學驗證指導原則

溶劑殘留方法學驗證

溶劑殘留檢查多采用氣相色譜法。一般認為殘留溶劑測定屬限度檢查,按相關指導原則只需提供專屬性、檢測限、定量限及進樣精密度等方法學研究資料，故未進行線性、準確度和耐用性方面研究。殘留量檢查究竟是屬于定量還是限度檢查的范疇，《化學藥物殘留溶劑研究的技術指導原則》中未明確規定。考慮到藥物合成情況比較復雜，根據所使用的有機溶劑種類、數量等的不同，殘留溶劑研究需要進行的程度、目標也可能不同，對方法學的要求也可能隨之不同。當檢測結果明顯低于規定限度時,?通常按限度檢查要求，無需得出準確含量；當檢測結果明顯高于規定限度（尤其當檢測結果為限度邊緣時），或需殘留溶劑量進行含量純度折算時，需按定量檢查要求進行方法學研究。?

一、系統適用性試驗?

取對照品溶液，進樣，記錄色譜圖。?

柱效：以被測物的色譜峰計，填充柱法的理論板數應大于1000，毛細管色?譜柱的理論板數應大于5000。?

分離度：色譜圖中被測物色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。?

重復性：以內標法測定時，對照品溶液連續進樣5次，所得被測物與內標物峰面積之比的相對標準偏差(RSD)應不大于5%；以外標法測定時，所得被測物峰面積的相對標準偏差(RSD)應不大于10%。?

二、專屬性?

1、對各種殘留溶劑定位和進行混合溶劑的分離度試驗，并附代表性圖譜。?取各種殘留溶劑對照品溶液，分別單獨進樣，記錄色譜圖。?取混合溶液，進樣，記錄色譜圖。?

2、排除供試品中的未知雜質或其揮發性熱降解產物對殘留溶劑的測定產生的干擾。?

①如果未知雜質或其揮發性熱降解產物與被測物的保留值相同（共出峰），通常采用在另一種極性相反的色譜柱系統中對相同樣品進行測定，比較不同色譜系統的測定結果的方法。如二者結果一致，則可以排除測定中有共出峰的干擾；如二者結果不一致，則表明測定中有共出峰的干擾。?

②熱降解產物與被測物的結構相同（如甲氧基熱裂解產生甲醇），通常要通過測定已知不含該溶劑的對照樣品來加以判斷。?

三、檢測限和定量限?

檢測限為信噪比3:1時相應濃度或注入儀器的量。定量測定時需驗證定量限，其限度為信噪比10:1時相應濃度或注入儀器的量。同時說明測試的過程和結果，并附圖譜。?

四、線性?

制備6個濃度，R=0.9990。附回歸方程、相關系數和線性圖。?

線性溶液濃度應從定量限濃度開始，至對照溶液濃度的120%以上。?

五、精密度

1、重復性?

①在規定范圍內，至少9個測定結果。設計三個不同的濃度進行測定。一般保留時間的RSD〈1%，峰面積的RSD〈5%。?

②以內標法測定時，對照品溶液連續進樣6次，所得被測物與內標物峰面積之比的相對標準偏差(RSD)應不大于5%；以外標法測定時，所得被測物峰面積的相對標準偏差(RSD)應不大于10%。保留時間的RSD〈1%。

2、重現性?

指不同實驗室之間不同分析人員測定結果的精密度。?當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現性試驗。?

六、準確度?

在規定的范圍內，至少9個測定結果。設計三個不同的濃度進行測定，計算回收率和相對標準偏差，含量測定的回收率應大于98%。?

進行回收率試驗時，由于采用頂空進樣系統，供試品與對照品處于不完全相同的基質中，此時應考慮氣-液平衡過程中的基質效應。

標準加入法可以消除供試品液基質與對照品溶液基質不同所致的基質效應的影響，故通常采用標準加入法驗證定量方法的準確性。當標準加入法與其它定量方法的結果不一致時，應以標準加入法的結果為準。?

標準加入法為精密稱（量）取被測定的殘留溶劑對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取一定量精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定殘留留劑的含量，再扣除加入的對照品溶液的含量，即得供試液溶液中殘留溶劑的含量；或按下式計算殘留溶劑的量。Cx=ΔCx/[（Ais/Ax）-1]，式中Cx為供試品中組分X的濃度；Ax為供試品中組分X的色譜峰面積；ΔCx為所加入的已知濃度的被測組分對照品；Ais為加入對照品后組分X的色譜峰面積。?

標準加入法測回收率?

步驟1?

精密稱量適量的藥粉，定容置100m容量瓶中，精密量取 5ml分別置5個10ml容量瓶中，各瓶中分別加入梯度的標樣，定容，分別測量各個瓶中的樣品，可以得到x1。?

請計算好?樣品量?和標樣的濃度！可以根據以前的數據算好！?

步驟2?

原理同步驟1。精密稱量適量的藥粉，量相當于步驟1的一半，定量加入標樣C，量和該步驟中稱取的藥粉中含被測物的量相當，再定容置100ml容量瓶中，以下步驟同步驟1。。。。。。?得到?x2?

回收率的計算要復雜一些，根據第一步是可以得到粉中被分析物的含量的。?第二步驟中藥粉中被測物的含量要利用第一步中的含量和取樣量來計算！C是理論加入的量，根據?x1?和?x2?可以算出測量的加入量?c‘回收率?＝?c’/C?*100%?

以上方法要求藥粉的溶解度非常好！可能更可行的方法如下：?精密稱取藥粉適量，定容置?25?ml?量瓶中，精密量取?溶液?2ml?，分別加入5?個頂空瓶中，在該頂空瓶中加入0.2，?0.4，?0.6，?0.8，?1.0?ml?的標樣，再補足溶劑，使各瓶的體積相等。?

用校正過的加樣槍?完成以上步驟！?

七、耐用性?

氣相色譜法中耐用性包括：載氣及流速，不同廠牌或批號的色譜柱、固定相、擔體，柱溫、進樣口和檢測器溫度改變，分流比調整等。資料中需說明小的變動?能否符合系統適用性試驗要求，以確保方法有效。

前我一般的制定有機殘留,操作是先看藥典附錄VIII P , 那個表,根據上面的限度.來設計. 樣品盡量多稱點.濃度配高點..根據那個限度.來推算對照品溶液的濃度.. 盡量多稱對照品,因為有機揮發快,再稱樣過程中會影響稱量.
比如甲醇限度是0.3%, 計劃1g樣品(具體根據溶解性來做)用溶解性很高的溶劑定容到10ml, 那么根據限度換算,對照品需要配置0.3mg/ml濃度.
稱對照品,最好先再容量瓶中裝一些溶劑.稱樣.滴定管懸空滴加. 方便稱量.
? ? 溶劑的選擇，應根據原料藥溶解性，選擇低毒性，且與待測的殘留組分分離好（事先可以參考沸點和柱子初步判斷）。

我覺得應該從以下幾點去做好殘留溶劑檢查，并應從以下幾個方面展開討論
一.首先應學習和熟練掌握中國藥典2005年版二部附錄Ⅷ P殘留溶劑測定法的有關要求；
主要是以下幾點：
1.色譜柱的選擇，一般現在都要選擇毛細管柱，如果你們公司很有條件，那么極性和非極性的色譜柱都購買吧！我們用的是中極性的色譜柱，一般做有機溶劑殘留大多數是可以了。
2.供試品溶液的制備，主要是根據供試品的溶解度來選擇，同時也要考慮對照品在該溶劑中的溶解性。一般首先選擇溶劑水、DMF、DMSO，再考慮其它溶劑。
3.測定法的選擇，等溫和程序升溫法，進樣方面主要有頂空和直接進樣法，這個主要根據自身實際條件來選擇。
4.其它就不多說了，主要看一下該殘留溶劑測定法后面的【附注】，藥品中常見的殘留溶劑及限度，還有相對保留時間的參考值，這個對實際做某個品種時很有用，可以提前大概知道該殘留溶劑的保留時間。
二、殘留溶劑檢查方法的選擇和驗證要點（姜連閣），這個很有用
1.概述
藥物中的殘留溶劑系指在原料藥或輔料的生產中，以及制劑制備過程中使用的，但在工藝過程中未能完全去除的有機溶劑。
按有機溶劑的毒性和對環境的危害，ICH將有機溶劑分為避免使用、限制使用、低毒和毒性依據尚不足四種情況。
因殘留溶劑會影響產品的安全性，故需對其進行研究。
2.殘留溶劑檢查方法的選擇
殘留溶劑的測定一般采用氣相色譜法，推薦使用毛細管色譜柱-頂空進樣系統，當然也可以使用普通填充柱，溶液直接進樣方法。
對不宜采用氣相色譜法測定的含氮堿性化合物，如N-甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如離子色譜法等。
測定殘留溶劑應從以下幾個方面考慮：確定被測的有機溶劑、選擇合適的色譜柱、制備供試品溶液和對照品溶液、選擇合適的進樣方法和滿足檢測靈敏度要求的檢測器，下面分別進行介紹：
2.1、確定被測的有機溶劑
根據制備工藝確定被測有機溶劑的范圍。通常應對制備工藝過程中使用的二類以上溶劑和重結晶用溶劑，以及根據工藝特點要求的其它溶劑進行殘留量的研究。建議對合成最后三步使用的三類溶劑也進行研究，這樣能更好地對未知峰進行歸屬；對制劑過程中使用的有機溶劑也建議考察其殘留情況，特別是緩、控釋微丸包衣過程使用的有機溶劑更應引起注意。
殘留溶劑的限度要求同ICH的規定。
2.2、選擇合適的色譜柱
按照相似相溶的原理選擇色譜柱。毛細管柱有極性柱、非極性柱、弱極性柱和中等極性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂漬適宜固定液的填充柱。
測定含氮的堿性有機溶劑時，由于普通氣相色譜儀的不銹鋼管路、進樣器襯管等對有機胺等含氮的堿性化合物具有較強的吸附作用，致使其檢出的靈敏度降低。通常采用弱極性色譜柱或經堿處理過的色譜柱分析含氮的堿性有機溶劑，如果采用胺分析專用柱進行分析，則效果更好。
2.3、供試品和對照品的制備
頂空進樣方法通常以水為溶劑，對于非水溶性的藥物，可采用DMF、DMSO或其他適宜溶劑。溶液直接進樣方法用水或合適的溶劑溶解樣品。
制備供試品的溶劑的選擇應兼顧供試品和被測有機溶劑的溶解度，且所用溶劑應不干擾被測有機溶劑的測定。水是首選溶劑，特別是頂空進樣系統。因為水中不含有機溶劑，故干擾較少，且在FID檢測器上，以水為溶劑時，各殘留溶劑的靈敏度最高。當藥物不溶于水時，可加入適當的酸或堿以增加藥物的溶解度，最好選用不揮發的酸或堿。以DMSO等為溶劑時，可加入一定量的水以增加檢測的靈敏度，或用鹽析的方法增加靈敏度。測定含氮的堿性溶劑時，供試品溶液應不呈酸性，以免被測物與酸反應后不易汽化。
對照品的制備方法應與供試品的制備方法相同。在申報資料中發現對照品（溶液）為直接進樣，供試品則為固體直接頂空進樣，供試品和對照品不但制備方法不同，而且進樣方法和進樣量也不同，無法進行比較。提請申報單位注意。
2.4、供試品溶液和對照品溶液濃度的確定
配制供試品溶液的濃度應滿足定量測定的需要，一般供試品取樣量在0.1～1g之間。限度檢查時對照品溶液的濃度可按規定的限度配制，定量測定時按實際殘留量配制，濃度相差最好以不超過2倍為宜。
2.5、檢測器的選擇
一般選用FID檢測器，對含鹵素的有機溶劑如氯仿等，采用ECD檢測器可得到更高的靈敏度。
通?？筛鶕幬锶軇┑臍埩羟闆r選擇合適的檢查方法。當需要檢查的有機溶劑數量不多，且極性差異較小時，可選擇毛細管色譜柱-頂空進樣-等溫法。當需要檢查的有機溶劑數量較多，且極性、沸點差異較大時，可選擇毛細管色譜柱-頂空進樣-程序升溫法；也可選擇填充柱或適宜極性的毛細管柱直接進樣法。
限度檢查（一類、部分二類溶劑）時采用內標法或外標法；定量測定（含量超過0.1%的二類或需要定量控制的三類溶劑）時采用內標法或標準加入法。
頂空進樣法還要對頂空溫度和頂空時間進行選擇。
頂空溫度應根據溶解供試品溶劑的特性及供試品中殘留溶劑的沸點選擇。以水為溶劑及測定低沸點殘留溶劑時，頂空溫度不宜超過85℃；測定沸點較高的殘留溶劑時，通常選擇較高的頂空溫度；但此時應兼顧供試品的熱分解特性，盡量避免供試品產生的揮發性熱分解產物干擾測定結果。以DMSO為溶劑時，頂空溫度不宜超過115℃。例如，在申報資料中發現，以水為溶劑，頂空溫度為100℃，柱溫60℃，結果高濃度的乙腈比低濃度的二氯甲烷的峰面積還小，原因是頂空溫度太高，大量的水被蒸發（或濃度被稀釋），隨著水蒸汽的凝結，在水中溶解度大的乙腈的靈敏度下降，產生了與事實不符的實驗結果。
頂空時間是要確保供試品溶液的氣-液兩相達到平衡，一般通過測定頂空時間與頂空氣體濃度的濃度—時間曲線來確定。頂空時間不宜過長，一般為30～45分鐘，如果超過60min，可能引起頂空瓶的氣密性變差,導致定量的準確性降低。如果平衡時間選擇10分鐘，就不能保證氣-液兩相達到平衡。
注意對照品溶液與供試品溶液必須使用相同的頂空條件。
甲酰胺、2－甲氧基乙醇、2－乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等不適宜用頂空法測定。
3、殘留溶劑檢查方法的驗證（我認為必做用紅色標識）

3.1、系統適用性試驗
柱效：用被測物的色譜峰計算，填充柱法的理論板數應大于1000，毛細管色譜柱的理論板數應大于5000。
分離度：色譜圖中被測物色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。
重復性：以內標法測定時，對照品溶液連續進樣5次，所得被測物與內標物峰面積之比的相對標準偏差(RSD)應不大于5%；以外標法測定時，所得被測物峰面積的相對標準偏差(RSD)應不大于10%。
3.2、準確度
在規定的范圍內，至少9個測定結果。設計三個不同的濃度進行測定，計算回收率和相對標準偏差，含量測定的回收率應大于98%。
進行回收率試驗時，由于采用頂空進樣系統，供試品與對照品處于不完全相同的基質中，此時應考慮氣-液平衡過程中的基質效應。標準加入法可以消除供試品溶液基質與對照品溶液基質不同所致的基質效應的影響，故通常采用標準加入法驗證定量方法的準確性。當標準加入法與其它定量方法的結果不一致時，應以標準加入法的結果為準。
標準加入法為精密稱（量）取被測定的殘留溶劑對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取一定量精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定殘留留劑的含量，再扣除加入的對照品溶液的含量，即得供試液溶液中殘留溶劑的含量；或按下式計算殘留溶劑的量。Cx=ΔCx/[（Ais/Ax）-1]，式中Cx為供試品中組分X的濃度；Ax為供試品中組分X的色譜峰面積；ΔCx為所加入的已知濃度的被測組分對照品；Ais為加入對照品后組分X的色譜峰面積。
3.3、專屬性
對各種殘留溶劑定位和進行混合溶劑的分離度試驗，并附代表性圖譜。
供試品中的未知雜質或其揮發性熱降解產物易對殘留溶劑的測定產生干擾。如果未知雜質或其揮發性熱降解產物與被測物的保留值相同（共出峰），或熱降解產物與被測物的結構相同（如甲氧基熱裂解產生甲醇）時，應通過試驗排除干擾。對第一類干擾，通常采用在另一種極性相反的色譜柱系統中對相同樣品進行測定，比較不同色譜系統的測定結果的方法。如二者結果一致，則可以排除測定中有共出峰的干擾；如二者結果不一致，則表明測定中有共出峰的干擾。對第二類干擾，通常要通過測定已知不含該溶劑的對照樣品來加以判斷。
3.4、其它
可根據是限度檢查還是定量測定選擇具體的驗證內容。
精密度：重復性和重現性，在規定范圍內，至少9個測定結果。設計三個不同的濃度進行測定。一般保留時間的RSD〈1%，峰面積的RSD〈5%。
線性：至少制備5個濃度，R=0.99。附回歸方程、相關系數和線性圖。
檢測限和定量限：檢測限為信噪比3:1或2:1時相應濃度或注入儀器的量。定量測定時需驗證定量限，其限度為信噪比10:1時相應濃度或注入儀器的量。同時說明測試的過程和結果，并附圖譜。

第二篇: 方法學驗證指導原則

***方法學驗證步驟

一、試驗目的：對方法的線性、精密度、重復性、穩定性、加樣回收率進行考察。

二、試驗方案：中藥質量標準分析方法驗證指導原則

三、樣品來源：金振口服液170101Z

四、色譜條件：

色譜柱：waters c18 250*4.6mm

流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（45:55）

流速：1ml/min

檢測波長：278nm

進樣量：10ul

五、試驗過程：

5.1線性關系考察

①儲備液制備：精密稱取黃芩苷對照品6mg置于50ml容量瓶中，用甲醇定容。作為母液。

②制備不同梯度標準系列溶液：

③每份對照品溶液進樣2針，算出平均峰面積，再計算回歸方程。

5.2精密度考察

供試品制備：精密吸取對照品溶液-母液，連續重復進樣6次，(可以和線性一個序列，再跑4針，共6針。都命名d6)測得峰面積，計算rsd值。

5.3穩定性考察

取5.4項下重復性考察樣品180609,在0、2、4、6、8、10、12h各進樣一次。命名都是170101z-1測得峰面積。計算rsd值。

5.4重復性考察

供試品制備：取180609批樣品，精密量取5ml，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。共平行制備6份供試品。命名170101z-1,170101z-2,170101-3,170101z-4，170101-5,170101z-6。每份樣品進樣2針。對照品濃度40ug/ml配置平行樣DZ1，DZ2.共進5針。，算出含量。計算rsd值。

重復性插在穩定性里面跑。

5.5加樣回收率

精密量取170101z樣品（比如：樣品含量0.58mg/ml）2.5ml，置50ml容量瓶中，加入黃芩苷含量為0.29mg/ml對照品溶液1ml。定容至50ml。共制備6份。每份樣品進樣2針。對照品濃度40ug/ml配置平行樣DZ1，DZ2共進5針，算出樣品含量。命名yp1，yp2，yp3，yp4，yp5，yp6。

第三篇: 方法學驗證指導原則

一、方法驗證

1．準確度 該指標主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求分別配制濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。 可接受的標準為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間，9個回收率數據的相對標準差（RSD）應不大于2.0%。

2．線性 線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為： 在80％至120％的濃度范圍內配制6份濃度不同的供試液，分別測定其主峰的面積，計算相應的含量。以含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。 可接受的標準為：回歸線的相關系數（R）不得小于0.998，Y軸截距應在100％響應值的2％以內，響應因子的相對標準差應不大于2.0%。

3．精密度 1）重復性 配制6份相同濃度的供試品溶液，由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試，所得6份供試液含量的相對標準差應不大于2.0%。 2）中間精密度 配制6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試，所得12個含量數據的相對標準差應不大于2.0%。

4．專屬性 可接受的標準為：空白對照應無干擾，主成分與各有關物質應能完全分離，分離度不得小于2.0。以二極管陣列檢測器進行純度分析時，主峰的純度因子應大于980。

5．檢測限 主峰與噪音峰信號的強度比應不得小于3。

6．定量限 主峰與噪音峰信號的強度比應不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液主峰的保留時間的相對標準差應不大于2.0%。

7．耐用性 分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次?？山邮艿臉藴蕿椋褐鞣宓耐衔惨蜃硬坏么笥?.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標準差應不大于2.0%。

8、系統適應性 配制6份相同濃度的供試品溶液進行分析，主峰峰面積的相對標準差應不大于2.0%，主峰保留時間的相對標準差應不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離，主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定。

二、 分 析 方 法 驗 證 （Validation）

進行驗證，以證明分析方法符合檢測的目的和要求，這就是分析方法驗證。從本質上講，方法驗證就是根據檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的試驗來驗證所采用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質量控制上有重要的作用和意義，只有經過驗證的分析方法才能用于藥品生產的分析檢測，方法驗證是制訂質量標準的基礎。 方 法 驗 證 內 容 包括方法的專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統適用性等，檢測目的不同驗證要求也不盡相同。

1.專 屬 性 （Speciality / Specificity）

專屬性是指分析方法能夠將產品和雜質分開的特性，也稱為“選擇性”。對于純度檢測，可在標準品中加入產品中的已知雜質，或者直接用粗品，考察產品峰是否受到雜質的干擾，對于過程跟蹤，可用反應體系樣品來考察有沒有其它的雜質干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質譜檢測器進行色譜峰純度檢查。一般要求產品和雜質之間的分離度大于2.0。

2. 線 性 （Linearity）

線性是在設定的范圍內，檢測結果與樣品中原料或產品的濃度呈線性關系的程度。線性是定量檢測的基礎，需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經過精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測物質的濃度（5個以上），按濃度從小到大運行序列，以峰面積和濃度的函數作圖，用最小二乘法進行線性回歸計算，考察分析方法的線性。

3. 范 圍 （Range）

范圍指在能夠達到一定的準確度、精密度和線性時，樣品中被分析物的濃度區間。簡單的說，范圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測的分析方法都需要對范圍進行驗證，純度檢測時，范圍應為測試濃度的80％～120％。

4. 準 確 度 （Accuracy）

準確度是指測定的結果與真實值之間接近的程度，所以也叫做“真實度”，需要定量得分析方法均需要驗證準確度。準確度應在規定的范圍內建立，對于原料藥可用已知純度的標準品或符合要求的原料藥進行測定，必要時可與另一個已建立準確度的方法比較結果。

5. 精 密 度 （Precision）

精密度是指在規定條件下，同一均勻樣品經多次取樣進行一系列檢測所得結果之間的接近程度。精密度一般用相對標準偏差（RSD）表示，取樣檢測次數應至少6次。 精密度可以從三個層次考察：重復性、中間精密度、重現性。

a、重復性（Repeatability）：是在相同的操作條件下、較短時間間隔內，由同一分析人員測定所得結果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測定6次的結果進行評價。

b、中間精密度（Intermediate precision）：同一實驗室，在日期、分析人員、儀器等內部條件改變時，測定結果的精密度。

c、重現性（Reproducibility）：指不同實驗室之間不同分析人員測定結果的精密度。

6. 檢 出 限 （Limits of Detection；LOD）

檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的最低量，不需要準確定量。檢出限體現了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行檢測，以能準確、可靠檢出被測物的最小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進行比較，以信噪比為3：1時的濃度確定檢出限，一般要求能夠達到進樣濃度的0.05%。

7. 定 量 限 （Limits of Quantitation / Quantification；LOQ）

定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的最低量，其測定結果需要一定的準確度和精密度，定量限體現了分析方法靈敏定量檢測的能力。檢測需要嚴格控制含量的雜質，必須考察方法的定量限，以保證雜質能夠被準確定量。一般以信噪比為10：1時相應的濃度或進樣量來確定定量限。

8. 耐 用 性 （Durability / Robustness）

耐用性是指測定條件發生小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動因素包括：流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經試驗，應說明小的變動能否符合系統適用性試驗要求，以確保方法有效。

9. 系 統 適 用 性 試 驗 （System Suitability）

液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗證時，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動相與實驗操作、待測樣品等一起當作完整的系統進行評估，并將系統適用性作為分析方法的組成部分，系統適用性便是對整個系統進行評估的指標。

一般系統適應性的要求為：分析方法能夠達到0.05%的檢出限；主峰的拖尾因子（T）0.95

第四篇: 方法學驗證指導原則

目的：建立分析方法學驗證的指導程序，用以證明所采用的分析方法適合于相應的檢測要求，保證驗證工作能夠有計劃、按步驟的進行，同時使與質量檢驗有關的活動符合GMP的要求。

范圍：適用于本公司所有的分析方法的驗證的活動。

職責：QC：負責起草分析方法驗證的驗證方案、報告；負責按批準的驗證方案執行驗證；負責檢驗儀器運行和保養。

QA：負責確定分析方法的驗證條件、標準、限度及檢驗方法；負責驗證方案、報告的審核；QA負責人負責方案、報告的批準。

1 相關定義

分析方法：法是為完成檢驗項目而設定和建立的測試方法，它詳細描述了完成分析檢驗的每一步驟。一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數、試劑、供試品溶液與對照品溶液的制備，測定，計算公式及檢測限度等。

方法驗證：方法驗證就是根據檢驗項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的實驗來驗證所采用的分析方法是否符合檢驗項目的要求。在建立產品質量標準時，分析方法需經驗證。

方法確認：在應用已驗證的藥典方法和其他法定方法前，應在當前的實驗室條件下進行方法確認來證明方法在該實驗室的適用性。

2 驗證的適用范圍

產品的物料、中間產品、中間過程控制和產品的理化分析方法的驗證和確認；

清潔驗證方法的驗證。

3 需要驗證的分析項目

根據檢驗項目的設定目的和驗證內容的不同要求，將需驗證的檢驗項目分為四類：

鑒別試驗；鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質。用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性和耐用性。

雜質的限度檢查與定量測定；雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如無機雜質，有機雜質等。雜質檢查分為限度檢查和定量測定兩部分。用于限度檢查的分析方法驗證側重專屬性、檢測限和耐用性。用于定量測定的分析方法驗證強調專屬性、準確度、精密度、線性、范圍、定量限和耐用性。

含量測定；含量測定對準確度要求較高，因此所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性等。

除此之外還有一些物理項目的檢測如粒徑分布、旋光度、熔點和硬度，其要求與其它檢驗項目有所不同，通常在進行分析方法驗證應有不同的要求。

《中國藥典》2010版關于不同的檢驗項目需要驗證不同的內容：

項目

內容

鑒別試驗

雜質測定

含量測定

定量

限度

準確度

－

+

－

+

精密度

重復性

－

+

－

+

中間精密度

－

+①

－

+①

專屬性②

+

+

+

+

檢測限（LOD）

－

－③

+

－

定量限（LOQ）

－

+

－

－

線性

－

+

－

+

范圍

－

+

－

+

耐用性

+

+

+

+

① 已有重現性驗證，不需驗證中間精密度；

② 如一種方法不夠專屬，可由其它分析方法予以補充。

③ 視具體情況予以驗證。

4 驗證內容

準確度

準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度。一般用回收率表示。準確度應在規定的范圍內測試。

驗證方法

準確度是定量測定的必要條件，因此含量測定、雜質定量測定均需驗證準確度。具體方法如下：

含量測定：可以用已知純度的對照品或供試品進行測定。也可以用本法所得結果與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較。如該分析方法已經測試并求出精密度、線性和專屬性，在準確度也可推算的情況下，準確度可向制可不必再做。

雜質的定量測定：可以向樣品中加入已知量雜質進行測定。如果不能得到雜質或降解產物，可用本法測定結果與另一成熟的方法進行比較，如藥典方法或經過驗證的方法。在不能測得雜質或降解產物的響應因子或不能測得對原料藥的相對響應因子的情況下，可用原料藥的響應因子。應明確單個雜質和雜質總量相當于主成分的重量比（％）或面積比（％）。

例如：測定含量的準確度, 按標示量的80%, 100%和120%配制三個濃度的溶液，每個濃度各分別制備3 份供試品溶液，進行測定。根據測定結果與配制濃度計算出平均回收率以及相對標準偏差。

數據要求：在規定的范圍內，至少用9個測定結果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3 份供試品溶液，進行測定。應報告已知加入量的回收率（％）或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或置信區間。

精密度

精密度系指在規定的測試條件下，同一均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

精密度與準確度的不同在于。精密度測定了一系列重復性的被分析物之間的接近程度，但它不能表達與已建立的真值之間的符合程度，后者由準確度來測定。通過一系列的測定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定與真實值相符，在這種狀況下，需要修改方法以消除偏差。

驗證方法

精密度可從重復性、中間精密度、重現性三個層次考察。

重復性：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性。

在規定范圍內，至少用9 次測定結果進行評價。例如，設計3 個不同濃度，每個濃度各分別制備3 份供試品溶液，進行測定3 次，或將相當于100％的濃度水平的供試品溶液，用至少測定6 次的結果進行評價。

中間精密度：在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度。

為考察隨機變動因素對精密度的影響，應設計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備。

重現性：在不同實驗室之間由不同分析人員測定結果之間的精密度，稱為重現性。

法定標準采用的分析方法或在不同實驗室之間進行方法轉移時，應進行重現性試驗。例如建立藥典分析方法時，通過協同檢驗得出重現性結果。協同檢驗的目的、過程和重現性結果均應記載在起草說明中，應注意重現性試驗用的樣品本身的質量均勻性和貯存運輸。

數據要求：均應報告標準差、相對標準偏差（變異系數）和置信區間。

專屬性

專屬性系指在其他成分(如：雜質、降解產物、輔料等)可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。通常,鑒別反應、雜質檢查、含量測定均應考察其專屬性。如一種方法不夠專屬，可由其它分析方法予以補充。

驗證方法

鑒別試驗：用于確認被測成分符合其特征。專屬性要求證明其能與可能共存的物質或結構相似化合物區分。

含被測成分的供試品呈正反應，而不含被測成分的供試品以及結構相似或組分中的有關化合物，應均呈負反應。

對于藥品，輔料不得干擾其有效成分的鑒別。

含量測定和雜質測定：色譜法和其他分離方法，應附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應標明諸成分在圖中的位置，色譜法的分離度應符合要求。

在雜質可獲得的情況下，對于含量測定，可向試樣中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果。對于雜質測定，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質與共存物質能得到分離和檢出，并具有適當的準確度與精密度。

在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質或降解產物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結果。或對試樣用強光照射，高溫，高濕，酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產物和降解途徑。對于含量測定應對比二法測定的結果。雜質檢查應比對破壞前后檢出的雜質個數。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測進行峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。

檢測限（DL ）

檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測出的最低量。鑒別試驗和雜質測定，均應通過測試確定方法的檢測限。

驗證方法

非儀器分析目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

信噪比法：用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1 或2：1 時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

除信噪比法外，還可根據響應因子的標準偏差和斜率計算出檢測限。

LOD =

式中：為響應值的標準差；

S為校正曲線的斜率，S= m。

斜率S可以通過樣品的校正曲線來估算。

的值可以由以下途徑估算。例如：根據空白的標準差（通過幾份空白樣品的分析，然后計算其響應值的標準差，測出分析背景響應值的大小），根據校正曲線（通過對含有檢測限范圍內被分析物樣品的分析來研究其標準曲線，回歸線的剩余標準差或回歸線的y軸截距標準差都可以作為標準差）。

數據要求：應附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結果。

定量限（QL）

定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。雜質和降解產物用定量測定方法研究時，應確定方法的定量限。

驗證方法

常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比為10：1 時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

除信噪比法外，還可根據響應因子的標準偏差和斜率計算出定量限。

LOD =

式中：為響應值的標準差（通過空白樣品測背景響應值或Y軸截距）；

S為校正曲線的斜率（通過樣品的校正曲線求得），S= m。

斜率S可以通過樣品的校正曲線來估算。

的值可以由以下途徑估算。例如：根據空白的標準差（通過幾份空白樣品的分析，然后計算其響應值的標準差，測出分析背景響應值的大?。鶕Ｕ€（通過對含有定量限范圍內被分析物樣品的分析來研究其標準曲線，回歸線的剩余標準差或回歸線的y軸截距標準差都可以作為標準差）。

線性

線性系指在設計的測定范圍內，檢測結果與試樣中被測物的濃度直接呈正比關系的程度。

線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量測定和含量測定均需驗證線性。

驗證方法

應在設計的測定范圍內測定線性關系?？捎靡毁A備液經精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進行測定，至少制備5個濃度的供試樣品。每一個濃度的樣品3份，以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性回歸計算。

數據要求：應列出回歸方程、相關系數和線性圖。

范圍

范圍系指能夠達到一定的精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定。含量測定需涵蓋的最低濃度范圍至少為標示量的80 -120% (ICH)，推薦包含50%-150%的濃度。雜質的定量測定，范圍應根據初步實測，擬訂為規定限度的±20%。如果含量測定與雜質檢查同時進行，用百分歸一化法，則范圍應為雜質規定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推薦包含LOQ －規定限度的＋20%。

耐用性

耐用性系指測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為使方法可用于常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。經試驗，應說明小的變動能否符合系統適用性試驗要求，以確保方法有效。如果通過耐用性研究發現分析方法對某個或某些測試條件敏感或要求苛刻，建議在方法中予以寫明。

典型影響耐用性的變動因素包括：被測溶液的穩定性、樣品的提取次數、時間等。

液相色譜法(HPLC)中的典型的變動因素包括：流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。

氣相色譜法(GC)中的典型影響耐用性的變動因素包括：不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、固定相、不同類型的載體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。

在評估HPLC 含量方法耐用性中部分需考慮的因素及變化范圍，實際變化范圍可依據使用條件設計。

HPLC中的變動因素

變化范圍

流動相的組成

有機相的±5%，例如：方法規定流動相緩沖溶液與乙腈的比例為50:50, 那么允許使用45:55 至55:45 范圍的比例。

流動相的pH 值

±, 如果已知pH 值為關鍵影響因素, 變化范圍應更小。

色譜柱

如可能，推薦使用同一品牌的填料可由不同供應商填充的色譜柱?？赏ㄟ^回顧實驗分析次數或方法研究確定色譜柱的質量。

柱溫

±5℃

溶液的穩定性研究

溶液的穩定性研究用來證明根據相應方法制備的樣品溶液和標準品溶液在規定的儲存條件下在一定時間內保持穩定。如果方法中沒有規定有效期，樣品溶液和標準品溶液需進行穩定性研究。

樣品溶液和標準品溶液依據方法進行配制和分析。在室溫或其他條件下（如冰箱2-8℃）條件下儲存適當的時間。每個間隔點，用新鮮配制的標準品溶液做對照，測定儲存的樣品溶液和標準品溶液。測定結果與初始結果進行比較，符合接受標準便可確認樣品溶液和標準品溶液在規定的儲存條件下在規定儲存時間是穩定的。

5 驗證接受標準

驗證結果原則上必須滿足下列標準，可以依據具體情況適當調整。

鑒別試驗(HPLC,TLC, GC)

驗證內容

接受標準

專屬性

色譜峰/斑點分離

鑒別試驗(IR/UV)

驗證內容

接受標準

專屬性

與標準物質響應相同，能清晰的與相似物質區分

含量( HPLC, GC,UV)

驗證內容

接受標準

精密度/重復性

RSD≤%，n≥6

中間精密度

RSD≤%，n≥4

專屬性

色譜法：色譜峰分離；

UV：UV 特征光譜；

IR：空白片的影響≤%。

專屬性峰純度

(必要時)

色譜峰基線分離，無干擾

UV：UV 特征光譜

IR：空白片的影響≤%。

證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。詳見準確度。

線性

--相關系數

--截距④

--響應因子RSD

r ≥

≤%⑤

≤%⑤

范圍

至少標示量（100% 溶液）的80 -120%

準確度

--平均回收率

--回收率的RSD

% (n=9， 3個濃度，每個濃度三份樣品)

≤%(n ≥9，至少3個濃度，每個濃度測3次)

穩定性

-樣品溶液

-對照溶液

規定時間內變化≤%

耐用性

系統適用性實驗通過

雜質的定量測定(副產品/降解產物，對映結構體)

驗證內容

接受標準

精密度/重復性

n≥6

限度＜%： RSD≤30%

≤限度＜%： RSD≤20%

≤限度＜%： RSD≤10%

≤限度＜5%：RSD≤%

限度≥5%： RSD≤%

驗證內容

接受標準

中間精密度

限度＜%： RSD≤40%

≤限度＜%： RSD≤30%

≤限度＜%： RSD≤15%

≤限度＜5%： RSD≤%

限度≥5%： RSD≤%

專屬性

峰純度(必要時)

色譜峰基線分離，無干擾

證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。

線性

--相關系數

--截距④

--響應因子RSD

r ≥

≤%⑥

限度＜ %： RSD≤10%⑥

≤限度< 5%： RSD≤%⑥

限度≥5%： RSD≤%⑥

范圍

報告限/LOD到標準的120%。

檢測限

信噪比≥3:1；RSD≤20%，n≥5

定量限

信噪比≥10:1；RSD≤10%，n≥5

準確度

--平均回收率

--回收率的RSD

(n=9，3 個濃度，三份樣品)

限度＜%： 80-120%

%≤限度< 5%： 90-110%

限度≥5%： 95-105%

(n=9，3個濃度，每個濃度測3次)

限度＜%： RSD≤10%

% ≤限度＜5%： RSD≤%

限度≥5%： RSD≤%

穩定性

-樣品溶液

-對照溶液

限度＜%：變化值≤20%

% ≤限度≤5%：變化值≤10%

限度≥5%：變化值≤5%

沒有新的色譜峰出現。

儲存期變化≤5%

④ 截距的絕對值；

⑤ 指回歸線的y 值對應于標示量(x=100%)時的濃度；

⑥ 指回歸線的y值對應于允許限度(雜質的標準)時的濃度。

在FDA質量控制實驗室檢查指南“15.方法驗證”中指出：許多含量和雜質的方法采用高效液相色譜法，對于這些方法的精密度的要求希望小于或等于系統適應性試驗的相對標準偏差。

美國藥典色譜法中對系統適應性試驗的RSD有如下規定：“對用于含量測定的標準溶液或其他標準溶液重復進樣分析，比較其結果來確認精密度是否符合要求。連續進樣5 次，除在方法中已明確規定外，其峰面積測量值的RSD應不大于%。如果5針的RSD大于% ，可連續進樣6次，其峰面積測量值的RSD應不大于%” 。

6 方法確認

適用范圍

適用于藥典方法和其他已驗證的法定標準。因為藥典方法和其他法定標準被認為是驗證過的分析方法，不需要驗證，但需要通過方法確認來證明方法在該實驗室條件下的適應性。

不適用于實驗室日常測試操作步驟不需要進行方法確認，例如（包括但不限于）干燥失重，熾灼殘渣，各種濕法化學步驟如酸值和簡單的儀器方法如PH 計，除非有特殊要求。

確認方式

對于方法確認，通常采用如下兩種方式：

由兩名檢驗人員分別獨立對同一批產品進行檢驗（如可能，使用不同的儀器），比較兩人的檢驗結果來證明方法在本實驗室（人員、分析儀器、試劑等）的適用性。

根據驗證目的和評估結果選擇相關項目進行確認，如下所示：

檢驗項目

準確度

精密度

專屬性

檢測限

定量限

線性

范圍

耐用性

HPLC 鑒別

﹣

﹣

±

﹣

﹣

﹣

﹣

﹣

HPLC有關物質

﹣

±

﹢

﹣

﹢

﹣

﹣

﹣

HPLC含量測定

﹣

±

±

﹣

﹣

﹣

﹣

﹣

備注：“﹢”代表該項目內容需要確認，“﹣”代表該項目內容不需要確認。“±”代表該項目內容根據實際情況評估確認。

7 分析方法的再驗證

產品的生產工藝/處方變更后；

產品的質量標準變更后；

原檢驗方法進行了修訂或檢驗條件發生了變更；例如：HPLC法的流動相種類 發生了改變、樣品準備方法有所變動、檢測的儀器或軟件平臺改變等。

8 驗證注意事項

驗證開始前應檢查與確認下列事項

所有涉及的儀器已完成驗證（安裝、運行、性能確認）并在校驗有效期內；

所有涉及的對照品（標準品）在有效期內；

所有涉及的容器、試劑應符合試驗要求；驗證操作人員已經過培訓，能夠完成驗證工作。

驗證過程應詳細記錄, 包括色譜條件，樣品、對照品、所用試劑的來源，含量，稱量值，稀釋過程，簡要操作方法，儀器型號，計算公式及結果，必要的數據統計等。

對操作過程中出現的任何偏差應予以記錄或調查，同時需填寫OOS處理和調查記錄或相應的偏差調查記錄，交QC、QA負責人審核簽字。

分析方法驗證中的所有圖譜，包括系統適用性的圖譜，都應該在檢測完畢后立即打印，并作為分析方法驗證報告的附件一同保存。檢測的所有信息，包括使用的儀器的型號，都應該在圖譜中顯示。

9 制定依據

ICH Q2A 《分析方法的驗證》、ICH Q2B《分析方法的驗證：方法學》；

《中國藥典（2010版）》附錄XIX A 藥品質量標準分析方法驗證指導原則；

《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》（附錄：確認與驗證）；

《FDA質量控制實驗室檢查指南》“15.方法驗證”。

10 變更歷史

前版文件編號

/生效日期

現版文件編號

/生效日期

變更內容

N/A

SMPQA-BF014-00

1.依據新版藥典和GMP的要求對文件內容作了修訂；

2.增加了驗證接受標準和方法確認內容；

3.依據公司實際情況，刪除了“微生物限度檢查的驗證要求”和“內毒素檢測的驗證要求”等項內容。

推薦訪問： 法學 指導原則 驗證