生物化學實驗報告

　姓

　名：

　學

　號：

　專業年級：

　組

　別：

　 *** 實驗教學中心

　第一部分

　一、實驗目的

　掌握程度 實驗主要目的

　1. 掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測定糖原含量的原理和注意事項，掌握其操作方法

　2.正確操作使用刻度吸管和可調微量取液器

　3.熟練運用溶液混勻的各種方法（試情況而定，采用合適的混勻方法）

　4.正確掌握溶液轉移的操作

　5、正確操作使用分光光度記 二、實驗原理

　掌握程度 實驗內容及原理 實驗名稱

　肝糖原的提取、鑒定與定量

　實驗時間

　*** 實驗地點

　*** 指導老師

　 趙***

　 組員

　*** 評分

　批改日期

　肝糖原的提取與鑒定

　糖原儲存在細胞內，采用研磨勻漿等方法可使細胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋白質變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質，而糖原仍穩定保存于上清液中，從而使用糖原與蛋白質等其他成分分離開來。糖原不溶乙醇而溶于熱水，故先用 95%的乙醇將濾液中的糖原沉淀，再溶于熱水中。

　糖原水溶液呈現乳樣光澤，遇碘變紅棕色。這是糖原中葡萄糖長鏈形成的螺旋中，依靠分子間引力吸附碘分子后呈現的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應和葡萄糖的還原性，可判斷肝組織中糖原的存在。

　CuSO 4 +2NaOH=Na 2 SO 4 +Cu(OH) 2 2Cu(OH) 2 +C 6 H 12 O 6 =2 CuOH+氧化型葡萄糖+H 2 O 2 CuOH= Cu 2 O (紅色)+ H 2 O Cu(OH) 2 = CuO（黑色）+ H 2 O

　肝糖 原定量測定

　糖原在濃酸中可水解為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進一步脫水生成糠醛衍生物—5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍色化合物。該物質在 620nm 處有最大吸收。糖含量在 10~100ug,溶液顏色的深淺可與可溶性糖含量成正比。利用此反應與同樣處理的已知葡萄糖含量標準溶液比色，可得到樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶

　液中非常穩定，故在顯色之前，肝組織先置于濃堿中加熱，以破壞其他成分，而保留肝糖原。

　 一、

　材料與方法

　1、實驗材料 樣品

　雞肝

　試劑

　肝糖原的提取與鑒定：95%乙醇，0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液，濃鹽酸，NaOH 溶液，碘試劑,班氏試劑。

　肝糖原定量測定：30%KOH 溶液，0.5mg/ml 的葡萄糖溶液，蒸餾水，蒽酮顯色劑。

　儀器和器材

　可見光分光光度計，恒溫水浴箱，試管架，三支試管，加樣槍，加樣槍架，普通離心機，研缽，刻度吸量管，白瓷反應器，100ml 容量瓶。

　2、實驗流程 肝糖原的提取與鑒定：

　雞肝約 1.5 g，剪碎 ＋5%CCl 3 COOH 1 ml 研磨至乳狀 ＋5%CCl 3 COOH 3 ml 研磨成肝勻漿

　全部轉入離心管中，離心 3 分鐘（4000 r / min）

　沉淀（棄去）

　上清（取 3 ml）

　＋3ml 95%乙醇，混勻，靜置 10 分鐘

　離心 5 分鐘（4000 r / min）

　上清（棄去）

　沉淀 ＋蒸鎦水 1 ml 沸水浴 2 分鐘，溶解沉淀

　 白瓷板孔穴中

　糖原溶液 1ml ＋濃 HCl 5 滴 加碘試劑 2 滴

　 加碘試劑 2 滴

　 沸水浴 15 分鐘，冷卻 糖原溶液 2 滴

　 ＋50%NaOH 5 滴

　 呈色對比

　糖原水解液 2 滴

　 糖原水解液 ＋班氏試劑 4 滴 混勻

　沸水浴 2 分鐘，觀察變化

　肝糖原定量測定

　雞肝 0.15 g ＋30%KOH 1.5ml

　沸水浴 15 分鐘

　冷卻，全部轉入 100 ml 容量瓶中

　加水至標線，仔細混勻，此為糖原提取液

　糖原的測定

　取 3 支試管，按下表操作。

　試劑（ml）

　空白管 標準管 樣品管 蒸餾水 1.0 — — 標準葡萄糖溶液 — 1.0 — 糖原提取液 — — 1.0 0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5 混勻，沸水浴 10 分鐘，冷卻c 。在分光光度計 620 nm 波長處，用空白管溶液調

　零，測定各管溶液的吸光度（A）。

　4、注意事項 肝糖原的提取與鑒定 ①在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混勻，可以用玻璃棒攪拌。

　②糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產生的顏色與葡萄糖殘基的多少有關。肝糖原分支中葡萄糖殘基在 20 個以下，吸附碘后呈現紅棕色。

　肝 糖 原 定 量測定

　 ①肝組織必須在沸水浴中完全溶解，否則影響比色； ②注意要收集全部溶液，用水多次洗試管，一并收入容量瓶中； ③加入蒽酮溶液時要小心操作，將試管放在試管架上進行； ④如果溶液呈渾濁，則因配制蒽酮溶液的硫酸濃度不夠所致。

　 第二部分

　一、實驗結果與處理

　1、實驗現象 操作過程 現象圖片

　（1 1 ）雞肝在三氯醋酸中，被研磨成肝勻漿

　(2) 雞肝研磨成肝勻漿后轉入試管

　（3 3 ）第一次離心后

　（4 4 ）第一次離心后上清液轉移到另一試管

　 （5 5 ）第二次離心后

　（6 6 ）第二次離心后的沉淀

　（7 7 ）沸水浴使沉淀溶解后

　 （8 8 ）糖原水解液

　（9 9 ）班氏試劑與糖原水解液反應：

　溶液顯藍色，磚紅色不明顯

　（ 10 ）

　白瓷板孔穴中糖原與碘反應（左邊為碘試劑與肝糖原溶液，右邊為碘試劑）: :

　紫色不明顯

　（ 11與 ）雞肝與 30% 的H NaOH 溶液混合在沸水浴中加熱后: :

　呈血紅色

　（ 12 ）糖原溶液裝入L 100mL 容量瓶混勻后：刻度線處有些許氣泡，混勻過程造成

　（ 13 ）糖原提取后的測定

　，三支試管水浴后（1 1 、2 2 、3 3 號試管分別為空白管、標準管、樣品管）：

　三只試管水浴 10min后，標準管顏色最為明顯，為綠色，加入的是標準葡萄糖溶液，樣品管與空白管顏色依次遞減。

　 2、實驗數據記錄 在分光光度計 620nm 波長處，測定各管溶液的分光度（A），記錄結果如下：

　各管吸光值 測定次數

　 空白

　 標準

　樣品 1

　 0.000

　0.350

　0.010

　 2

　 0.000

　0.351

　0.011

　3

　 0.000

　0.353

　0.013

　3、實驗結果

　肝糖原的提取與鑒定：

　顯色反應中，碘液由黃色變為紅棕色（不明顯），說明所提供材料中含糖原成分，但含量低；加入班氏試劑的溶液無明顯的顏色變化；

　肝糖原定量測定

　（1）雞肝所取質量：0.15g （2）各管吸光值

　各管吸光值 測定次數

　 空白

　 標準

　樣品 1

　 0.000

　0.350

　0.010

　 2

　 0.000

　0.351

　0.011

　3

　0.000

　0.353

　 0.013

　 平均值

　 0.000

　 0.351

　0.011

　標準管吸光度平均值 0.351； 樣品管平均吸光度 0.011；

　由公式計算：

　11 . 1 *1000100*g100* 05 . 0 * 100 / g）

　肝組織重（ 標準樣品肝組織）

　肝糖原（AAg ?注：1.11 為此法測得的葡萄糖含量換算為糖原含量的常數，因為用蒽酮試劑顯色時，110ug 糖原與 100ug 葡萄糖顯色程度相當。

　故經計算最后結果為 0.116(g/100 肝組織)。

　 4、討論與分析 （1）與碘試劑反應時：加入糖原的孔穴并沒有出現明顯的紅棕色。可能原因如下：

　A、是在取糖原沉淀時，沉淀很少，糖原含量也很少； B、碘試劑本身是黃色的，本來現象就不是很明顯，這樣一來，幾乎看不到反應會產生的紅棕色了，說明糖原含量極少。

　（2）糖原中葡萄糖的鑒定：實驗結果也沒有如預期中的藍色溶液沸水浴后變為磚紅色。原因如下：

　A、沸水浴過程水溫沒有達到 100 攝氏度，且期間多個小組先后放、取水浴箱中的試管，對反應造成一定影響； B、糖原含量極少，又加過少量酸與堿，濃度更小，現象更不明顯，所以觀察不到明顯的磚紅色。

　（3）在肝糖原定量測定中，由資料可知飽食雞肝的肝糖原含量為：2～3g/100g 肝組織。而我們的結果明顯偏低，實驗中沒有出現操作上的失誤，討論分析原因如下：

　A、所用雞肝來源并非飽食雞的肝，且雞肝每個部位肝糖原的含量有差異，與其他實驗組對比，可能我們組所取雞肝的部位剛好是肝糖原含量較低的部位； B、查資料得知若肝糖原含量<1％時，蛋白質會干擾蒽酮反應，這可能對實驗結果進一步造成降低的影響。

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