生物化學實驗報告

　姓

　名：

　* * ***

　 學

　號：

　專業年級：

　組

　別：

　 * * **** 實驗教學中心

　 實驗名稱

　Folin- - 酚試劑法測定蛋白質含量

　實驗時間

　*** 實驗地點

　*** 指導老師

　組員

　*** 評分

　批改日期

　第一部分

　一、 實驗目的

　掌握程度 實驗主要目的

　了解蛋白質含量測定的常用方法

　 掌握 Lowry’s 法（Folin-酚試劑法）測定蛋白質含量的原理和基本操作技術

　 掌握制作標準曲線的要領和通過標準曲線求樣品溶液中待測定物質含量的方法

　二、

　實驗原理

　掌握程度 原理 具體內容

　 雙縮脲反應

　 在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與 Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡合物,這個反應叫做雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有與雙縮脲結構相似的多個肽鍵, 因此有雙縮脲反應。即在堿性溶液中，蛋白質分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的 Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質- Cu2+復合物。

　 Folin-酚顯 Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩定，其磷鉬

　 色反應

　 酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍色反應(鉬藍和鎢藍的混合物)。由于蛋白質中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應。即蛋白質- Cu2+復合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。

　 標準曲線

　 在一定濃度范圍內，藍色的深淺度與蛋白質濃度呈線性關系，故與同樣處理的蛋白質標準液比色即可求出蛋白質的含量。

　即根據預先繪制的標準曲線求出未知樣品中蛋白質的含量。

　 三、

　材料與方法

　1、實驗材料

　 本次實驗儀器

　1. V-1100 分光光度計 2. 恒溫水浴箱 3. 試管 6 支、試管架 4. 加樣槍、加樣槍架 5. 坐標紙 本次實驗試劑

　1. 牛血清白蛋白標準液（200μg/ml）

　2. 堿性硫酸銅溶液（當日有效）

　3. Folin-酚試劑 4.健康人血清（300 倍稀釋）

　 2、實驗方法

　 3、操作步驟：

　試劑（ ml) 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白標準液 樣品液（稀釋 0 300 倍）

　蒸餾水 堿性硫酸銅

　蛋白質濃度（μ g/ml ）

　- - 1.0 2.0 0 0.20 - 0.80 2.0 40 0.40 - 0.60 2.0 80 0.60 - 0.40 2.0 120 0.80 - 0.20 2.0 160 - 0.50 0.50 2.0 未知 （1）各管混勻，室溫放置 10min。

　（2）向各管內加入 Folin-酚試劑 0.20mL, 2s 內迅速混勻！

　40℃放置 10min。

　（3）冷卻至室溫后，以 500nm 波長比色，用 1 號管作空白，讀取各管吸光度。

　4、注意事項 Folin- - 酚 試 劑的穩定性問 題 Folin-酚試劑在酸性條件下較穩定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質作用生成堿性的銅-蛋白質溶液。故當 Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），蛋白樣品 堿性銅試劑 混勻，放 10min 加酚試劑 2s 混勻 水浴 10min 比色 放至室溫

　 使還原反應發生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

　時間問題 因 Lowry 反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。即第 1 支試管加入 2.0mL 堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1分鐘后，第 2 支試管加入 2.0mL 堿性硫酸銅試劑，2 分鐘后加第 3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到 10 分鐘，則第 1 支試管可立即加入 0.20mL Folin-酚試劑，1 分鐘后第 2 支試管加入 0.20mL Folin-酚試劑，2 分鐘后加第 3 支試管，以此類推。水浴 10min，冷卻后，每一分鐘測一管。

　 第二部分

　一、實驗結果與處理

　1.數據記錄

　測定次數 各管吸光度測量值 A500 2 號試管 3 號試管 4 號試管 5 號試管 6 號試管 1 2 3 平均值 A500 0.030 0.031 0.032 0.031 0.063 0.064 0.065 0.064 0.088 0.087 0.087 0.087 0.147 0.144 0.144 0.145 0.136 0.133 0.133 0.134

　 2.繪制標準曲線 標準曲線y = 0.0008xR 2

　= 0.954100.020.040.060.080.10.120.140.160 50 100 150 200c(ug/ml)A（吸光度）A(吸光度）0.000線性 (A(吸光度）0.000)

　二、實驗結果的計算和討論

　1、結果計算

　如上圖 y=0.0008x 當 y=0.134 時 x=167.5ug/ml 血清中含有的蛋白質數有為：167.5×2×300×0.001=100.5g/l

　2、討論與分析 參考：正常人的血清蛋白濃度范圍為 60-80g/l

　實驗結果：實驗測得正常人血清蛋白含量是 100.5g/l

　實驗的失誤可能發生在: 導致失敗的可能原因 A、時間沒有嚴格控制好，在實驗時沒有嚴格按照實驗時間要求操作，造成 Lowry 反應的顯色隨時間過長，顏色過深，使結果偏大 B、用于加蒸餾水的加樣槍出現問題，加入的蒸餾水量偏小

　 其他能影響實驗誤差的原因 C、分光光度計的裝液管有洗不凈的污染 D、Folin-酚試劑，牛血清白蛋白標準液為多個小組共同使用，有可能在之前組被污染

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