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【摘要】 目的：探討TFPI-2在食管鱗癌組織中的表達及其臨床意義。方法：采用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）SP法測定TFPI-2在食管鱗癌組織、癌旁組織、正常食管組織中的表達。結果：TFPI-2表達陽性指數在食管鱗癌組織、癌旁組織、正常食管組織中分別為（16.25±9.57）%、（22.41±7.24）%、（27.76±5.30）%。食管鱗癌中淋巴結轉移、大小、浸潤深度、TNM分期及腫瘤的分化程度與TFPI-2的表達陽性指數則呈負相關（rs分別=-0.315、
-0.444、-0.647、-0.772、-0.292）。結論：TFPI-2與食管鱗癌的生長、轉移、侵襲有關，是判斷食管癌預后的有效指標。
【關鍵詞】 食管鱗癌； TFPI-2； 免疫組織化學
【Abstract】 Objective：To explore the expression and clinical significance of TFPI-2 in esophageal squamous cell carcinoma.Method：The expression and clinical significance of TFPI-2 in normal esophageal epithelium，adjacent tissues and esophageal squamous cell carcinomaby Immunohistochemistry.Result：The positive index of the expression of TFPI-2 in normal esophageal epithelium，and adjacent tissues，and ESCCs were respectively（27.76±5.30）%，（22.41±7.24）%，（16.25±9.57）%.The positive index of the expression of TFPI-2 in normal esophageal epithelium，and adjacent tissues，and ESCCs showed an increasing trend，the result was significant（P<0.05）.Among ESCCs，the index of the expression of TFPI-2 was negative correlated with the degree of malignancy（rs=-0.292），lymph node metastasis（rs=-0.315），size（rs=-0.444），invasion depth （rs=-0.647）and TNM classification（rs=-0.772）.And there were no difference in patients with different age，sex，tumor location and pathologic type.Conclusion：TFPI-2 is relate with the growth，metastasis and invasion of esophageal squamous cell carcinoma，is an effective indicator to determine the prognosis of patients.
【Key words】 Esophageal squamous cell carcinoma； TFPI-2； Immunohistochemistry
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College， Weihui 453100，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.21.004
食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤，食管癌中鱗癌最常見，約占食管癌的90%。我國是全世界食管癌發病率和死亡率最高的國家。隨著醫學診療技術水平的不斷提高，手術方法的不斷改進，切除率顯著提高，手術死亡率也大大降低，但5年生存率仍在30%～40%之間徘徊。食管癌預后差的主要原因是由于腫瘤對周圍組織的侵襲，以及在腫瘤早期就發生鄰近組織和遠端組織的轉移。TFPI-2即組織因子途徑抑制物2，是一種絲氨酸蛋白酶抑制物，可抑制纖溶酶、胰蛋白酶、基質金屬蛋白酶（MMPs）等多種蛋白酶活性。近年來的研究發現，TFPI-2通過抑制MMPs等多種機制，降低腫瘤的侵襲能力，在抑制腫瘤發生侵襲和轉移的過程中發揮重要作用[1-3]。
1 資料與方法
1.1 一般資料 本實驗的標本來自2009年4月-2010年7月新鄉醫學院第一附屬醫院胸外科食管鱗癌患者行根治性切除病例。選擇臨床病理資料完整的52例食管鱗癌病例、28例癌旁（3 cm<距腫瘤邊緣<5 cm）病例為研究對象；同時選擇28例食管鱗癌切除標本上、下斷端（距腫瘤邊緣>5 cm）的正常食管組織作為正常對照組。
1.2 方法
1.2.1 試劑 兔抗人VEGFR-3多克隆抗體：購自上海普林斯頓生物科技發展有限公司 （1：100）。兔抗人TFPI-2多克隆抗體：購自北京義翹神州生物技術有限公司（1：200）。通用型SP-9000檢測試劑盒（549257A）：購自北京中杉金橋公司；3，3-二氨基對二氨基聯苯（3，3-Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（549257A）：購自北京中杉金橋公司。
1.2.2 免疫組化染色步驟（SP法） （1）切片烤片后常規二甲苯脫蠟，遞減梯度酒精（無水乙醇、95%酒精、80%酒精I、II）各3 min脫蠟至水。（2）新鮮配制3%H202，于室溫下避光浸泡10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。（3）PBS液洗3次，每次5 min。（4）檸檬酸緩沖液浸泡，微波修復（高火加熱至沸騰后，降至低火，加熱共20 min后，自然冷卻至室溫）。（5）PBS液洗3次，每次2 min。（6）滴加通用型的正常山羊血清工作液室溫下與濕盒中封閉10 min。（7）PBS液洗3次，每次5 min。（8）滴加一抗：A兔抗人VEGFR-3多克隆抗體：購自上海普林斯頓生物科技發展有限公司（1∶100）。置于濕盒中4 ℃過夜，B兔抗人TFPI-2多克隆抗體：購自北京義翹神州生物技術有限公司（1∶200），置于冰箱中4 ℃過夜。（9）PBS液洗3次，每次5 min。（10）每張切片滴加1滴（約50 μL）二抗（1%BSA-PBS）， 37℃下孵育20 min。（11）應用DAB溶液顯色，鏡下控制染色時間。（12）自來水充分沖洗，蘇木素復染。（13）梯度酒精脫水。（14）二甲苯透明、中性樹膠封片。
1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件包，根據資料類型分別采用 字2檢驗、t檢驗、方差分析及Spearman等級相關分析進行統計學處理。以P<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 TFPI-2在食管鱗癌組織、癌旁組織和正常食管組織中表達 陽性指數=（TFPI-2陽性染色面積/視場面積）×100%。TFPI-2表達陽性指數在食管鱗癌組織、癌旁組織、正常食管組織中分別為（16.25±9.57）%、（22.41±7.24）%、（27.76±5.30）%。三組間比較，F=19.233，P=0.000；鱗癌組織與癌旁組織比較，P=0.015；鱗癌組織與正常食管組織比較，P=0.000；癌旁組織和正常食管組織比較，P=0.002。差異均具有統計學意義。
2.2 癌組織中TFPI-2的表達與各臨床病理因素之間的關系 食管鱗癌中淋巴結轉移、大小、浸潤深度、TNM分期及腫瘤的分化程度與TFPI-2的表達陽性指數則呈負相關（rs分別=-0.315、-0.444、-0.647、-0.772、-0.292）。見表1。
3 討論
TFPI-2，過去又叫胎盤蛋白5（placenla protein 5，PPS），基因位于人類染色體7q22，全長約7.0 kb，整個TFPI-2基因由5個外顯子（由羅馬數字指定）和4個內含子（由字母命名）組成。是一種相對分子量為32 kDa的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由多種細胞合成并定向分泌到細胞外基質（ECM），它是介導或調節細胞外基質降解和重塑的質粒[1，4-5]。TFPI-2蛋白的4級結構中包含有能夠抑制多種絲氨酸蛋白酶的結構元件，其反應活性部位能與多個絲氨酸蛋白酶（糜蛋白酶、纖溶酶、纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶、FXa、血漿激肽釋放酶及基質金屬蛋白酶等）對應的活性位點結合，對這些酶的活性起到競爭性抑制作用[4]，纖溶酶及基質金屬蛋白酶家族參與了ECM的降解和重塑，大量研究表明這些絲氨酸蛋白酶在腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移，腫瘤組織中新生血管生長、傷口愈合、血栓的溶解吸收及等病理生理過程中發揮了重要作用[4-5]。降解是腫瘤侵襲和轉移的關鍵一步，而TFPI-2蛋白保護ECM不被降解，維持ECM結構完整性，一些侵襲性比較強的腫瘤組織中TFPI-2的表達顯著下調。Miyagi等[6]1996檢出TFPI-2基因定位于染色體的7q22，7號染色體的缺失常見于多種腫瘤，包括小細胞肺癌、胃腺癌以及骨髓瘤等多種惡性腫瘤，提示TFPI-2基因的改變參與了腫瘤的演進。腫瘤組織中TFPI-2的下調也可能是TFPI-2基因序列中的CpG被甲基化后促使其基因的轉錄沉默而實現的[7]。TFPI-2基因還被認為是一種抑癌基因，而CpG島是該基因調控的主要位點。Miyagi等[8]報道在九種胰腺癌細胞株中TFPI-2基因序列中的CpG甲基化發生率為77.8%。
在食管鱗癌中，基質金屬蛋白酶等表達上調促進細胞外基質的降解，而TFPI-2作為基質水解酶抑制劑表達下調[9-10]。TFPI-2表達的下調可能促進食管癌鱗癌細胞惡性行為的發展。因此TFPI-2表達陽性指數在正常食管上皮、癌旁組織、癌組織中的表達指數呈遞減趨勢，差異極顯著（P<0.05）。
TFPI-2在多種腫瘤中表達下調，與腫瘤的生長、侵襲及轉移有關[11-13]，在多數腫瘤中TFPI-2表現出抑制腫瘤細胞生長、侵襲及轉移的負性調節作用。食管鱗癌細胞無論是局部生長還是通過血道或者淋巴管道形成遠處轉移，或對周圍組織侵襲，首先都要降解或破壞細胞外基質，從而導致TFPI-2表達下調[14-15]。本組實驗結果顯示食管鱗癌中TFPI-2的表達陽性指數明顯下降，其陽性指數與食管癌淋巴結轉移、浸潤深度、腫瘤大小、分化程度、TNM分期呈負相關。
目前關于TFPI-2與食管鱗癌的關系少有報道，但是根據TFPI-2在細胞外基質中的作用及食管鱗癌細胞的特性，有理由相信，在食管鱗癌生長、侵襲和轉移的過程中TFPI-2扮演了重要的角色，其具體作用機制是否也是TFPI-2基因序列中的CpG甲基化導致的，尚待進一步研究。本實驗結果使得對食管鱗癌中TFPI-2下調機制的研究提供了可行性探索，也為改善食管鱗癌的預后和尋找新的治療切入點提供了線索。
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（收稿日期：2015-01-12） （本文編輯：陳丹云）
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