摘要：一把傘南星有多種藥用價值，其中的內(nèi)生細菌具有產(chǎn)生相同活性藥用成分的潛力。對分離自峨眉山一把傘南星的28株內(nèi)生細菌進行68項表型性狀測定，包括唯一碳源利用、唯一氮源利用、對抗生素和染料的抗性、耐鹽性、耐酸堿性、生長溫度范圍等。結果表明：一把傘南星內(nèi)生細菌具有較強的抗逆性，較強的耐低溫和耐弱酸性能力，14%的菌株能在4 ℃條件下生長，所有菌株均能在18 ℃條件下生長，96%的菌株能耐受1%NaCl，86%的菌株能在pH值5的條件下生長；聚類分析表明，在Watson距離為0.2時可聚為7個表觀群。

關鍵詞：一把傘南星；內(nèi)生細菌；數(shù)值分類法；表型；多樣性

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0228-02

收稿日期：2013-11-06

基金項目：四川省教育廳項目（編號：12ZA240）；樂山師范學院科研項目（編號：Z1160、 Z1223）。

作者簡介：胥成浩（1961—），男，四川西充人，碩士，副教授，從事微生物資源及生物化學、分子生物學研究。E-mail：157791327@qq.com。

通信作者：龔明福，博士，教授，主要從事微生物資源及微生物與植物間相互關系研究。 E-mail：gongmingfu98@163.com。植物內(nèi)生細菌是指能在植物組織內(nèi)部定殖，并且對宿主植物不產(chǎn)生明顯病害或副作用的細菌[1]。內(nèi)生細菌與植物協(xié)同進化過程中，某些內(nèi)生細菌具有了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似生物活性物質(zhì)的能力[2]。一把傘南星[Arisaema erubescens （Wall.） Schott]是天南星科（Araceae ）天南星屬（Arisaema）植物，多年生草本，以球狀塊莖入藥[3]。一把傘南星可被用于臨床燥濕化痰、祛風止痙、散結消腫，是重要的解毒中藥，還可治療癰腫及蛇蟲咬傷[4]，其提取物草酸鈣針晶對釘螺有一定的毒殺作用[5]；另有提取物對Hella細胞、肉瘤180、HCA肝癌實體型、U14、U27等有很強的抑制作用或有殺蟲活性[4]。隨著該植物藥用價值被不斷發(fā)現(xiàn)，市場需求量不斷增長，導致該植物野生資源日益減少，合理開發(fā)和保護一把傘南星資源日益重要[6]。本研究采用純培養(yǎng)方法從峨眉山一把傘南星中分離內(nèi)生細菌，并進行多項表型性狀測定，對測定結果進行數(shù)值分類，以期明確一把傘南星內(nèi)生細菌的表型多樣性，同時為一把傘南星綜合開發(fā)和保護利用提供菌種資源。

1材料與方法

1.1植物樣品

一把傘南星采自峨眉山七里坪（海拔約1 300 m）。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1分離用培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏5 g，蛋白胨3 g，NaCl 5 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉18～20 g，蒸餾水1 L。

1.2.2表型性狀測定用基礎培養(yǎng)基WHITE培養(yǎng)基。A 組分：NaNO3 2.5 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 2 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，純化瓊脂 20 g，水 1 L；B 組分：葉酸 2 mg，煙酸 10 mg。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中去除瓊脂。

1.3一把傘南星表面消毒

取健康的一把傘南星植株，用剪刀剪取根、莖、葉各5 g，自來水沖洗表面的泥土等污物后放于無菌培養(yǎng)皿中，無菌水浸洗3～5次，用有效氯含量為5%的次氯酸鈉處理3次，每次2 min，無菌水沖洗3～5次，最后將已完成表面消毒的樣品放入無菌攪拌機中，加無菌水打漿，粉碎的組織液置于無菌三角瓶中備用[7]。將上述表面消毒處理最后1遍清洗的無菌水直接涂布于NA培養(yǎng)基平板上，與試驗組相同條件下培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長，如果沒有菌落生長則表面消毒完全；若有少量菌落生長，則觀察菌落形態(tài)、顏色等特征，并除去試驗組的相同菌落以排除干擾[1]。

1.4內(nèi)生細菌的分離

在紫外消毒后的潔凈操作工作臺中，取100 μL打漿后的組織勻漿于培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)2 d以待細菌長出。觀察平板中生長出菌落的形態(tài)、顏色、大小等特征，挑取不同單菌落分別劃線接種于相應的培養(yǎng)基平板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，重復以上步驟直至菌種純化。平板中無其他菌落，再轉(zhuǎn)接單菌落到斜面培養(yǎng)基，并分別編號為YBSO1至YBSO28，28 ℃ 培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)至 4 ℃保存菌種。

1.5菌懸液的制備

將保存的菌株在NA斜面中活化，再將活化的菌株接種于NA培養(yǎng)液（即不加瓊脂的NA）中，28 ℃恒溫搖床培養(yǎng) 3 d，制備菌懸液，用于表型性狀測定。

1.6表型性狀測定

1.6.1唯一碳源的利用將供試碳源（D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-海藻糖、D-阿拉伯糖、甘露醇、D-麥芽糖、D-核糖、D-半乳糖、D-山梨醇、丙酮酸鈉）分別加入蒸餾水中溶解，通過過濾法除菌，使碳源終濃度為0.1%，再將碳源溶液和0.5 mL WHITE B組分混合，待冷卻至50 ℃左右加入WHITE A培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。用多點接種器將制備好的菌懸液接種于已制備好的平板上（每接1個平板粘1次菌液，以保證接種量一致），以NA平板為陽性對照，以不加碳源的WHITE平板為陰性對照，每個處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)2 d觀察結果，長勢優(yōu)于陰性對照為“生長”，記錄為“1”，否則記錄為“0”。

1.6.2唯一氮源的利用將WHITE培養(yǎng)基A組分中的NaNO3去除，加入待測氮源（L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、甘氨酸、硝酸鉀、L-苯丙氨酸），使其終濃度為0.1%，另加入10 g/L葡萄糖作碳源。其余方法同“161”節(jié)。

1.6.3抗生素抗性的測定按說明書要求，將供試抗生素（紅霉素、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、潔霉素、白霉素）分別配制成5、30、50、100 mg/L，加入融化冷卻至50 ℃左右的NA培養(yǎng)基中，制成含不同濃度抗生素的平板，以NA平板作為對照，接種后置28 ℃培養(yǎng)，接種、觀察、培養(yǎng)方法同“1.6.1”節(jié)。長勢近似或優(yōu)于NA平板的記錄為“1”，否則記錄為“0”。

1.6.4對染料的抗性測定將染料（剛果紅、孟加拉紅、甲基橙、亞甲基藍、甲基紅）用水溶解，按終濃度0.1%、0.2%加入NA培養(yǎng)基滅菌后倒平板，以NA平板作為對照，接種、培養(yǎng)、觀察、對照的設置及記錄方法同“1.6.1”節(jié)。

1.6.5耐鹽性的測定在NA培養(yǎng)基中分別加入1%、5%、10% NaCl，滅菌后倒平板，接種供試菌株，以NA平板為對照，培養(yǎng)及觀察、記錄方法同“1.6.1”節(jié)。

1.6.6耐酸堿性的測定在NA培養(yǎng)基倒平板前用滅菌的HCl、NaOH分別調(diào)節(jié)pH值至3、5、6、8，接種后置28 ℃培養(yǎng)，以pH值7的NA為對照。接種、觀察及記錄方法同“161”節(jié)。

1.6.7生長溫度范圍的測定將供試菌株接種于NA平板上，分別置于4、18、28、50 ℃下培養(yǎng)，以28 ℃下培養(yǎng)為對照。接種、觀察及記錄方法同“1.6.1”節(jié)。

1.7聚類分析

對測定的表型性狀結果按照陽性反應記為“1”、陰性反應記為“0”、不確定反應記為“N”，編碼后輸入計算機，并去除全同性狀，用DPS軟件[8]按平均連鎖聚類法進行聚類，得出樹狀圖。

2結果與分析

2.1峨眉山一把傘南星內(nèi)生細菌分離結果

從峨眉山一把傘南星中分離得到28株內(nèi)生細菌，依次編號為YBS01至YBS28。

2.2供試菌株理化特性

2.2.1唯一碳源的利用96%的供試菌株能利用D-鼠李糖、D-甘露糖、D-海藻糖、D-核糖、D-麥芽糖、D山梨醇、丙酮酸鈉、甘露醇，部分菌株也能利用D-半乳糖、D-木糖。

2.2.2唯一氮源的利用所有供試菌株都能利用L-苯丙氨酸、D-天冬氨酸；78%的菌株能利用L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、D-蛋氨酸、甘氨酸，部分或少部分菌株能利用L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸。

2.2.3抗生素抗性的測定所有供試菌株都能耐受5 mg/L的所有供試抗生素，至少有30%菌株能耐受100 mg/L的紅霉素、白霉素、青霉素、潔霉素，但所有供試菌株對30 mg/L以上的慶大霉素和卡那霉素敏感，生長受到抑制。

2.2.4染料抗性的測定所有供試菌株都能耐受0.1%、0.2%的剛果紅、孟加拉紅、甲基橙，所有菌株均不能耐受0.1%、0.2%的亞甲基藍、甲基紅。

2.2.5 耐酸堿性本研究中，在pH值 3、5、6、8的條件下分別有1、24、27、8株菌株能生長；沒有菌株能在pH 值10的環(huán)境下生長。

2.2.6耐鹽性所用供試菌株中沒有菌株能耐受10% NaCl，14%菌株能耐受5% NaCl，96%菌株能在1% NaCl中生長。

2.2.7生長溫度范圍14%菌株能在4 ℃條件下緩慢生長，但長勢不如28 ℃；在18、28 ℃條件下全部菌株都能生長；沒有菌株能在50 ℃高溫下生長。

2.3一把傘南星內(nèi)生細菌數(shù)值分類結果

對供試菌株測定的表型性狀數(shù)據(jù)采用平均連鎖法進行聚類分析，獲得數(shù)值分類樹狀圖。從圖1可以看出，所有內(nèi)生細

菌在Watson距離為0.2時可以聚分為7個表觀群，其中YBS12（D群）、YBS21（E群）、YBS15（F群）、YBS18（G群）可以獨自形成表觀群，A群有10株菌株，B群有7株菌株，C群也有7株菌株。

3結論

通過對28株內(nèi)生細菌進行的68項表型形狀測定可知，所有內(nèi)生細菌在Watson距離為0.2時可以聚為7個表觀群，因此具有顯著的多樣性。在pH值5的情況下，有86%的菌株能生長，也有14%的菌株能在5% NaCl的環(huán)境下生長，在較低溫度下也有很大一部分菌株能生長。與一般植物內(nèi)生細菌相比，一把傘南星內(nèi)生細菌更具抗性、耐低溫，因此一把傘南星內(nèi)生細菌更具有開發(fā)價值。內(nèi)生細菌有著豐富的多樣性，同時還具有許多優(yōu)良特性，因此在內(nèi)生細菌的利用上有著豐富的菌種資源，可以利用這一特性，通過生物技術方法定向改變植株內(nèi)生細菌，從而改變植株的生長環(huán)境等，達到實現(xiàn)經(jīng)濟價值的目的。通過內(nèi)生細菌數(shù)值分類樹狀圖可知，內(nèi)生細菌種類在植株間變化不大，同一地區(qū)采集的植株具有極高的相似性，但在不同環(huán)境下采集的植株卻表現(xiàn)出多個表觀群，因此環(huán)境是決定內(nèi)生細菌特性的重要因素。

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