【關鍵詞】 沙門氏菌；檢測

doi：103969/jissn1004-7484（s）201306736 文章編號：1004-7484（2013）-06-3418-02

沙門氏菌因美國病理學家DE沙門于1884年發現本屬菌中的豬霍亂桿菌而得名。本屬菌是一群抗原構造和生物學性狀相似的革蘭氏陰性桿菌。菌型繁多，已發現有2000種以上的血清型，我國已發現216個[1]。引起人類疾病的沙門氏菌大多屬于A、B、C、D、E，5個血清群，病型有①傷寒與副傷寒（統稱腸熱癥）：由傷寒沙門氏菌、甲型和乙型副傷寒沙門氏菌等引起；②食物中毒：可由不同菌型引起，以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌等最為常見；③敗血癥：由豬霍亂沙門氏菌等引起，此外，還可引起慢性腸炎。人感染沙門氏菌后，可呈無癥狀帶菌，也可表現為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態或死亡率，嚴重威脅著人們的身體健康。為了有效預防沙門氏菌病，人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程中，做出了不懈的努力，特別是在免疫學、生物化學、分子生物學等方面，開發各種新型快速檢測技術，提高了沙門氏菌檢測的速度和質量，有效預防和控制沙門氏菌的傳染。由于其樣品來源極為繁雜，盡管各國學者對其進行了長期研究，仍存在不少問題。將有關檢測進展綜述如下：

1 傳統的培養方法[2]

所有患者均在知情同意情況下進行腹水細菌陽性培養及藥敏實驗，抽取患者腹水時嚴格按照無菌操作進行，并將腹水接種到裝有葡萄糖肉湯的培養試管中。對于培養結果為陽性的患者應轉種到慷慨平板及血平板中，并將單個菌落分離鑒定。應用MIC法對革蘭氏陽性菌及陰性菌進行鑒定。革蘭氏陽性菌患者采用GP法鑒定進行藥敏實驗，革蘭氏陰性菌患者應用GN021法進行藥敏實驗[2]。上述所有操作必需嚴格按照無菌操作以及試劑盒說明書進行。

2 免疫學方法

免疫學方法是以抗原和抗體的特異性結合反應為基礎，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌，通過病原體刺激機體產生免疫球蛋白（抗體）的方法。

21 酶聯免疫吸附試驗上世紀80年代，隨著單克隆抗體技術問世并日益成熟，抗沙門氏菌各種O抗原、H抗原單抗都隨之建立起來，并取代了常規因子血清進行血清學鑒定、傷寒診斷，顯示出單抗的優越性能。目前正在研制腸炎沙門氏菌特異性單克隆抗體Hgm，兩株單抗聯合使用將會更準確地檢測腸炎沙門氏菌。文其乙等人在前人基礎上應用沙門氏菌屬特異性單克隆抗體CB8和de7建立了檢測沙門氏菌的直接ELISA方法，并形成了快速檢測試劑盒[3]。

22 斑點酶聯免疫吸附試驗斑點酶聯免疫吸附（Dot-ELISA）試驗是一項免疫學檢測技術。桑杰等以硝酸纖維膜為固相載體，利用沙門氏菌多價血清和辣根過氧化物酶（HRP）標記制備的羊抗兔IgG，成功地建立對香腸的Dot-ELISA檢查法，同時，采用常規分離培養鑒定技術作為對照試驗。結果顯示，在86份香腸中，用Dot-ELISA檢出沙門氏菌陽性為36份，陽性率為4186%；而常規分離培養鑒定技術檢出沙門氏菌陽性為34份，陽性率為3952%，經統計分析，t=0311，P﹥005，兩種方法差異不具統計學意義[4]。

23 全自動熒光酶標免疫快速篩選法（mini-VIDAS快速篩選法）Mini-VIDAS快速篩選法是一套全自動食品致病菌檢測方案。沙門氏菌的抗原鑒別是基于在VIDAS儀器內進行的酶聯熒光免疫分析。沸煮一定的增菌肉湯，加入試劑條內，肉湯中的混合物在特定的時間內循環于SPR內外。沙門氏菌抗原存在則與包被在SPR內的單克隆抗體結合，堿性磷酸酶的抗體在SPR內外循環與結合在SPR內壁上的沙門氏菌抗原結合。廢物-4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉化成熒光物-4甲基傘形酮。熒光強度由光學掃描器測定。試驗結果由計算機自動分析。產生基于熒光測試的試驗值與標準比較后打印出每一個被測樣品的陽性或陰性結果報告。利用此方法進行沙門氏菌檢測，只要增菌培養基，不需純培養，增菌——上機后49h即可檢測出結果。具有省時、方便、靈敏、假陽性少等特點[5]。

3 分子生物學方法

31 分離培養 ①取對數生長的沙門氏菌細胞，經消化后接種在預先放置蓋有玻片的6孔板中；②待細胞生長成單層后將蓋玻片取出，并采用PBS將細胞洗滌3次；③采用4%的多聚甲醛在4℃的溫度下進行固定，并采用PBS溶液將細胞進行洗滌3次；④并在通透細胞膜中加入5%的Triton溶液浸泡15min，并采用PBS洗滌3次；⑤采用甲醇溶液將內源性過氧化物酶進行封閉，并于室溫20℃采用PBS溶液將樣本洗滌3次；⑥將含有二抗的正常動物血清放濕盒進行封閉，并于室溫下20℃進行放置；⑦將懸浮液中加入羊抗人β波形蛋白單克隆抗體，并在37℃溫度中將樣本進行孵育2小時，并在4℃的冰箱中放置保存；⑧往樣本溶液中加入生物素化二抗，并在室溫下孵育15min，同時采用PBS溶液洗滌3次；⑨往樣本溶液中加入過氧化物酶標鏈霉素，并在室溫下孵育15min，同時采用PBS溶液洗滌3次；⑩往樣本溶液中加入DBA顯示劑對樣本進行顯色；○11采用自來水對樣本進行洗滌，并采用蘇木素對樣本進行復染，進行封片，并在顯微鏡下觀察樣本細胞的情況。

32 轉染 ①在轉染前一天，將細胞消化并分別接種在6個孔板中，同時在濃度為5%的CO2溶液中將其孵化道培養箱中，當細胞鋪滿孔板約60%-80%時對樣本進行轉染；②轉染方法按照生廠商提供實驗方法進行操作；③將含有陰性熒光的Notch1100pmol中的Notch1轉染培養后與含有5ug的脂質體的Notch1進行轉染培養，并靜置20min后將其制備為轉染復合物；④將轉染復合物加入到轉染的培養基中，并加入轉染培養基將每個孔的體積調至2000uL；⑤將樣本溶液置于含有CO2的培養箱中進行孵化培養5-7h后，更換含有10%的胎牛血清以及雙抗的DMEM/F12培養液中繼續培養24h；⑥在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染的情況，并根據轉染率=熒光視野細胞數/明視野細胞數x100%，從而計算細胞轉染率；⑦beta-catenin Notch1轉染方法同上。

33 總RNA的提取 總RNA的提取方法如下：①當孔板長滿細胞至85%-95%時，將上清液去除，并采用PBS將上清液漂洗2次；②在每孔中加入1mLTrizol試劑，并對樣液進行搖勻，同時在無菌操作臺上進行消化3-5min，直接細胞脫壁，樣液粘稠為止；③在每個孔中將消化好的細胞裂解液吸收到處理過的15mL的EP試管中，并加入氯仿02mL，對樣品液輕搖至15s；④將樣本溶液于室溫下靜置3min后，將樣本溶液置于4℃中進行離心15min；⑤取上清液置新的EP管中，并加入05mL的異丙醇，同時在室溫下靜置10min；⑥將樣本溶液進行離心10min，直至見到RNA沉淀于EP管底內部；⑦將上清液棄置，并采用75%的乙醇將樣本溶液進行洗滌，并在4℃中進行離心15min；⑧將上清液棄置，采用小Tip吸干液體，將沉淀物風干，并加入CEPC處理水，吹打均勻，并在水浴中將RNA溶解，測定OD值。

34 逆轉錄 按照RT試劑盒的操作經逆轉錄獲取cDNA，具體方法如下：①準備EP試管065mL。②冰上操作：往EP管中加入10uL的DEPC水，1uL的引物，總RNA含量為1UL，并進行短暫離心。③將樣本置于65℃的水浴中加熱5min，并立刻置于冰上。④反應體系：含有4uL的5x RT Buffer，1uL RNA，2uL的10mMdNTP，10uL RNase free H2O，1uL 濃度為10U/uL的Rnase inhibitor，1uL的ReverTra Ace，總體系溶液為20uL。⑤反應條件：在42℃中反應20min；95℃中反應5min，在4℃中反應5min。⑥將樣本置于cDNA在溫度為﹣20℃中進行保存。

35 將變性蛋白樣品進行SDS﹣PAGE電泳 ①清洗玻璃板；②灌膠：將凝膠充分聚合后，拔出加樣孔；③加入適量電泳緩沖液，并提取蛋白樣本100ug，小心加入樣孔中；④濃縮凝膠以60V進行電泳30min，分離膠則以100V進行電泳90min，并以蛋白marker條帶進行分開，采用溴酚藍結束電泳時間；⑤轉膜：取與凝膠面積大小相當的醋酸纖維膜用甲醛進行浸泡5min，并置于轉膜緩沖液中制備備用，按照3層濾紙，按照醋酸纖維素濾膜、凝膠、3層濾紙的順序逐張進行疊放，在凝膠上面合上夾子，講氣泡趕走，并將其置于預冷轉膜槽中，給予足量的轉膜緩沖溶液，并以200mA的電流進行電泳；⑥免疫反應：采用TBST膜置于5%脫脂牛奶進行封閉，并在溫室搖床中搖勻1小時。分別加入beta-catinen、MMP﹣9單克隆抗體，并在4℃中孵化過夜，并在常溫下對樣本進行脫色，置于搖床中進行搖勻，并采用TBST進行洗滌3次，每次洗滌時間為10min。加入辣根過氧化物酶標鼠抗羊二抗，并在室溫下孵育1小時，置于搖床中進行搖勻，并采用TBST進行洗滌3次，每次洗滌時間為10min；⑦曝光處理：采用ECL發光試劑盒對樣本進行化學熒光反應，并在暗室環境中壓片5min，加入顯影液，定影液3min；將膠片進行拍照及掃描，凈光密度值采用凝膠圖像處理系統進行分析。

參考文獻

[1] 王秀茹預防醫學微生物學及檢驗技術[M]北京：人民衛生出版社，2002309-318

[2] GB /T47894 – 2008食品衛生微生物學檢驗-沙門氏菌檢驗[S]

[3] 文其乙，焦心安直接 ELISA 檢測沙門氏菌方法的建立及其應用研究[J]中國獸醫學報，1995，15（2）：105-111

[4] 桑杰，史小為Dot-ELISA 檢查香腸中沙門氏菌的研究[J]草業與畜牧，2007，（03）：6-8

[5] 付麗紅，王曉聞酶聯免疫吸附法在沙門氏菌檢測中的研究進展[J]中國釀造，2009（1）：6-8

[6] 王晶，王林，黃曉蓉主編食品中沙門氏菌的快速篩選法[A]食品安全快速檢測技術[M]北京：化學工業出版社，200210：138-144

[7] 楊平，楊迎伍，陳偉，等食品中四種致病微生物的多重 PCR 快速檢測技術研究[J]西南大學學報（自然科學版），2008，29（5）：90-94

[8] 陳弟事，郭萬柱，徐志文，等豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及 PCR 檢測方法的建立[J]安徽農業科學，2007，35（20）：6020-6023

[9] 李光偉，邱楊，肖性龍，等沙門氏菌熒光實時定量PCR 檢測試劑的研制和應用[J]微生物學通報，2007，34（3）：496-499

[10] H irose K，Itoh KI，N akajim a H，et alSelective amplification of lyv（rfbE），pa（rfbS），viaB，and flie genes by multiplex PCR for identification of salmonella enter case rovars typhi and paratyphiA[J]JC lin Microbiol，2002，（40）：633-636

[11] Cocolin L，Man zanoM，AstoriG，et alA highly sensitive and fast no radio active method for the detection of polymerase chain reaction products from salmonella serovars，such as salmonella typhi in blood specimens[J]Immanuel Med Microbial，1998，22（3）：233-239

[12] Baumler A J，H effron F，Reissb rod t RRapid detection of salmonella enteric a with primers specific for iro B[J]JM icrobiol，1997，（35）：1224-1230

[13] C alva E，Ordonez L G，Fen andezMora M，et alDistinctive IS200 inscrtion between gyrA and resC genes in salmonella typhi[J]J Clin Microbiol，1997，35：3048-3053

[14] D avidW，Jane T，S ion PGDetection of PCR products using self probing amp icons and f fluorescence[J]Nature Biotechnology，1999，（17）：804-807

[15] 謝曉東，蔣蓉芳，宋偉民蝎形引物PCR 快速檢測環境水樣中沙門氏菌[J]環境與職業醫學，2003，20（2）：115-119

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